标准操作流程

（以 C57/ICR 小鼠为例）

 

一、设备和试剂准备

 

（一）仪器设备

超净工作台或者生物安全柜、水浴锅、蠕动泵(LongerPump，YZ1515X）、手推式电动废液缸、一次性 100mm 培养皿 1 个、乳胶管（灭菌、长度 168cm， 规格充满 14ml 液体）、灭菌剪刀和镊子若干、灭菌动脉夹、灭菌止血钳、一次性输液针（黑色 0.7*25）、电动移液器、一次性 15/50mL 离心管若干、一次性 50mL注射器及 0.22μm 过滤器若干、100mL 无菌试剂瓶、离心机、泡沫板、废液托盘、固定针头、一次性 5ml 巴氏吸管、75%酒精及其喷壶、0.4%台盼蓝及血球计数板、碎冰、泡沫盒、新鲜配置 6%的戊巴比妥钠。

 

 

 

 

（二）试剂盒试剂耗材

表 1  试剂盒清单

名称	货号	规格	数量
灌注溶液A	LV-PHIK00101	500mL/瓶	1 瓶
灌注溶液B	LV-PHIK00102	500mL/瓶	1 瓶
细胞洗液	LV-PHIK00103	500mL/瓶	1 瓶
活细胞纯化液	LV-PHIK00104	30mL/瓶	1 瓶
0.22µm 过滤器	LV-PHIK00105	5 个/包	1 包
20mL 注射器	LV-PHIK00106	5 支/包	1 包
70µm 细胞筛	LV-PHIK00107	5 个/包	1 包
精选胶原酶	LV-PHIK00108	5 支/盒	1 盒
EGTA 母液 (100x)	LV-PHIK00109	1.1mL/支	5 支
抗生素	LV-PHIK00110	16mL/瓶	1 瓶

 

 

（三）试剂准备

1）灌注溶液 A（LV-PHIK00101）工作液：无菌条件下，取 100mL 灌注溶液 A 至 100mL 无菌试剂瓶，补加 1mL EGTA 母液（LV-PHIK00109）、1mL 抗生素（LV-PHIK00110）。注意：理论上 70mL 灌注溶液 A 工作液足够灌注一只小鼠，在熟练的情况下可进一步优化。

2）灌注溶液 B（LV-PHIK00102）工作液：无菌条件下，取 100mL 灌注溶液 B，取一支精选胶原酶（LV-PHIK00108），利用约 20mL 灌注溶液 B  充分溶解精选胶原酶，0.22µm 过滤器（LV-PHIK00105）过滤，最后补加 1mL 抗生素（LV-PHIK00110）。注意：理论上 70mL 灌注溶液 B 工作液足够消化一只小鼠，在熟练的情况下可进一步优化。

 

二、试验装置试运行

 

（一）设备、耗材、试剂等放在合适的位置；将灌注溶液 A 工作液、灌注溶液 B 工作液放入水浴锅，水浴锅温度调至 37℃，预热 60 分钟（需计时），使酶活性更加稳定；细胞洗液放入 4℃冰箱预冷 30-60 分钟；将设备按照以下布局进行管道连接，打开细胞房、工作台的洁净风，紫外照射 15 分钟。

 

 

 

（二）此步骤在上述预热过程中完成：动物称体重，将动物用 6%的戊巴比妥钠 80mg/kg 进行麻醉（麻醉时间约 2 小时内有效），麻醉后用酒精喷全身进行消毒，在泡沫板上（废液托盘上）用固定针固定好四肢。

（三）准备一次性 100mm 皿，加入 10mL 灌注溶液 B 工作液，常温放置于灌注装置附近；将细胞洗液和 50mL 离心管插入碎冰中预冷。

（四）将乳胶管插入灌注溶液 A 工作液中，打开蠕动泵，确定蠕动泵运行方向，测试管道是否运行平稳，确认管道内无气泡；

 

（五）小鼠灌注速度为 7-9 mL/min（根据动物大小适当调整），根据经验设置蠕动泵转速，通过单位时间内收集的液体体积测定流速；记录目标转速后，将转速调至 1r/min，待用。

 

三、实验步骤

 

（一）用镊子夹起小鼠腹部表层皮肤，并从中间剪一小口后向两侧剪开直至暴露整个内层皮肤，将皮剪除；

（二）换新的无菌剪子与镊子，夹起腹部内层皮肤从中间剪一小口后向两侧剪开直至暴露整个腹腔，用固定针固定两侧皮肤以及内层皮肤，防止皮毛污染肝脏细胞；

（三）用镊子轻轻将胃及肠子往右翻开，暴露下腔静脉，打开蠕动泵（此时流速是 1r/min），将注射针（链接灌注液，整个灌注装置已排除空气）插入下腔静脉，开始灌注，见肝脏有变白则立即剪断肝门静脉；将灌流速度缓慢加大到7-9mL/min，流速可以 1-2ml/秒的速度递增（建议让助手调节流速）；并剪破心脏，用止血钳或者动脉夹夹住上腔静脉，此时夹住肝门静脉可见肝脏较易膨大并立起来，说明插入位置正确灌注成功。

（四）小鼠灌注溶液 A 工作液 70ml，约 6-8min；灌注溶液 B 工作液 70ml， 约 6-8min。灌注溶液 B 工作液的灌注过程中，需将肝门静脉夹住 5 次，每次约2-5 秒，使肝脏膨胀，肝内增加的压力有助于肝脏的消化，从而提高产率。

（五）灌注消化液直至肝脏失去弹性，用镊子按压肝脏，肝脏会形成明显压印，说明消化完成。

（六）将肝脏快速（1-2min 内）从动物身上解离下来，转移到盛有 10mL 灌注溶液 B 工作液的培养皿中，将组织扯破，小心将细胞抖落；如消化充分，可及时加入足量细胞洗液。（此时所有涉及肝细胞处理的步骤必须使用无菌器材并且动作要轻柔，此时的肝细胞非常脆弱，并且易受剪切力的损伤）。加入足量预冷细胞洗液（总的细胞洗液体积为 30ml），细胞悬液过 70μm 细胞筛（提前底部

预湿）。

 

（七）50g，4℃，5min 离心。预冷细胞洗液（约 30ml/1-2 只小鼠肝细胞） 重悬细胞，轻轻吹散细胞，50g，4℃，5min 离心，重复 2 次。

（八）预冷细胞洗液重悬细胞（约 30ml/1-2 只小鼠肝细胞），台酚蓝（台酚蓝：细胞=1:9）计数。

一般而言 8-12 周龄的 C57 小鼠，每只可分离出的原代肝细胞总产量在3-5×10⁷ 个，平均产量应该约为4×10^7，产量低于3×10^7/鼠表明操作过程出错。活的、健康的肝细胞具有明亮、清澈、平滑、小而圆的外观。受损、死亡的细  胞通常呈蓝色、肿胀、粗糙、呈颗粒状（此标准对其它物种肝细胞也是一样的）。

（九）细胞纯化：如果活力过低（低于 80%），需要进行纯化处理。

 

1、50g，4℃离心 5 分钟，去上清；如纯化 1 只小鼠的肝细胞，在 50mL 离心管中利用 10mL 活细胞纯化液（LV-PHIK00104）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心地加入 5ml 细胞洗液（LV-PHIK00103）（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）。

2、800×g，4℃离心 20 分钟，降速加速度设置为 1；离心后，吸取活细胞纯化液（LV-PHIK00104）和细胞洗液（LV-PHIK00103）之间浑浊带（活细胞层），转移到新的 50mL 离心管中，加入 2 倍体积的细胞洗液（LV-PHIK00103），上下轻轻颠倒混匀，50×g，4℃离心 5 分钟。

3、去掉上清并用小鼠铺板培养基（推荐 LV-WEP006）重悬细胞，细胞计数， 确定纯化效果。理论上细胞活力可达 85%以上。

 

四、细胞培养

 

活细胞数 1×10^5/cm2（活力>80%），胶原包被培养板中小鼠铺板培养基培养 1 -2小时后，轻轻换液 1 次，将死细胞去掉，提升细胞状态；过夜培养后换成小鼠维持培养基（推荐 LV-WEM006）。