产品名称	Cat. No.	规格	组分
1402 Quick Cloning Kit	1402-1	50 rxns	1 tube of 4X Cloning Enzyme Premix
	1402-5	250 rxns	5 tubes of 4X Cloning Enzyme Premix

 

储存于 -20˚C.

 

• 概述

本产品利用特殊的重组原理，不依赖于连接酶，可实现简单、快速、高效的DNA定向克隆。载体可通过任意方法线性化，然后与两端含有15~25bp载体同源区域的PCR片段重组，反应时间短，重组效率>95%，并可实现多至5个片段的高效无缝克隆。

2.   优势 

• 可插入任意载体的任意位置 
• 一步，简单，准确，快速地进行多片段定向克隆，反应仅需15min，效率高达95%
• 不依赖于连接酶，PCR产物无需酶切，无需磷酸化
• 无缝连接，不引入额外序列

• 克隆实验流程

 

I: 载体线性化，可酶切或通过PCR方法

II: 目的片段制备，PCR产物5’和 3’最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致 

III: 载体，目的片段按摩尔比~1:3与克隆试剂混匀，50°C孵育15~30min

IV: 反应产物转化

 

• 具体克隆实验操作

 

I: 载体线性化

线性化载体是克隆成功的重要前提，可通过酶切获得，平末端或者粘末端均可，双酶切更有利于降低背景；也可提供PCR扩增获得，高保真DNA聚合酶可避免产生不必要的突变。 

II: 引物设计

目的片段扩增所需的正反向引物除含有与自身匹配的特异性序列外，均需含有与载体末端同源的15~25bp重叠序列，如需添加酶切位点，接头序列，标签序列等，可添加在二者之间。即：

PCR Forward Primer = 载体正向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段正向特异性序列(20~25bp)

PCR Reverse Primer = 载体反向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段反向特异性序列(20~25bp)

若要克隆多个目的片段，片段间引物设计原理与上相同。

III: 目的片段制备

目的产物需选用高保真DNA聚合酶进行扩增，由于PCR引物通常较长，退火温度可根据特异性区Tm值及聚合酶本身确定。

IV: 克隆反应体系

	Recommended Amount
4X Cloning Enzyme Premix	5 μl
Linearized vector	40~80ng
Inserts	载体ng数*3*片段大小(bp)/载体大小(bp)=ng
Total Volume	20 μl

 

 反应物轻轻混匀后，50°C 15~30min。反应结束后可直接用于后续转化或者-20°C保存备用。

注：1）重组片段为2~3段时，载体与各片段加入量约为0.02 – 0.5 pmols，重组片段为4~6段时，载体与各片段加入量约为0.2 – 1 pmols，载体与加入目的片段的最佳摩尔比为1:3

2）重组片段较多时，可适当延长反应时间至1h

 

V: 转化

 

1.  把感受态细胞置于冰中解冻； 

2.  加入用于转化的重组反应产物20μl ，冰中放置30min后，42℃ 热激60～90s； 

3.  继续冰上放置2min； 

4.  添加 500 μl S.O.C 或者 LB培养基， 37˚C 摇床培养 1 h；

5.  将转化菌液离心后弃上清，轻轻将 沉淀悬浮后均匀涂布于含有适宜抗性的LB平板上；

6.  37˚C 倒置过夜培养

 

• 注意事项

 

Problem	Probable cause	Solution
转化后菌落很少或者没有	DNA浓度太低	使用推荐的DNA用量.
	目的片段或载体中含有污染.	PCR产物及线性化载体均需纯化
	感受态细胞效率太低	使用效价>1×108 cfu/µg 的感受态细胞效果更好
	载体线性化不完全	载体切胶回收
阳性克隆较少，多为空载体	被含有相同抗性的载体污染	PCR产物中可能含有模板质粒，推荐切胶回收
	平板抗性错误	确保平板新鲜配制且添加正确抗生素.
	载体酶切不完全	酶切时间延长可增加线性化程度，降低背景