产品名称	Cat. No.	规格	组分
PV2  DNA 聚合酶	1401-1	250 U	5X PV2 缓冲液与聚合酶
	1401-5	5 X 250 U	5X PV2 缓冲液与聚合酶

      

 将聚合酶与缓冲液储存于-20˚C.

概述

PV2 DNA 聚合酶是一种超保真DNA聚合酶，该酶结合了杂交技术与融合技术以获得优越的可靠性、高特异性和长的目标长度性能，显著地减少全部的PCR延伸时间。通过融合一段增强区大大提高了持续合成能力，提高了PCR扩增速率，结合该酶的3’-5’核酸外切酶活性使得其保真性是普通Taq酶的数十倍。而该酶的独特结构使其即便在有PCR抑制剂存在的情况下，也能快速有效的得到目的产物。

PV2  DNA 聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性，PCR扩增产 物为平末端。

优势

• 保真度高：确保PCR复制的精确程度
• 快速：延伸时间短（15-30秒/kb）
• 方便：功能强劲，只需最少的优化
• 高产量：用更少的酶，获得更高的产量

应用

• 高保真PCR
• 快速PCR
• 高通量PCR
• 长片段或困难模板扩增
• 克隆

储存条件

20mM Tris-HCl（pH7.4 @ 25°C），100 mM KCl，1 mM DTT，0.1mM EDTA，稳定剂，50% 甘油

反应条件

50µl反应体系中含有：1X PV2缓冲液，DNA模板，0.5µM上下游引物，0.2mM dNTP，3% DMSO（可选），1U PV2 DNA聚合酶。

单位定义

一个单位 PV2 DNA聚合酶可在 74°C，在 30 分钟内向不溶于酸材料中掺入 10 nmol脱氧核糖核苷酸。

热失活

无

PCR扩增反应建立

为了得到理想的PCR结果，我们建议所有的试剂使用前都要充分混匀并离心，整个反应操作在冰上进行，并迅速将反应转移到预变性（98°C）的PCR循环仪上。为避免PV2  DNA 聚合酶3’-5’核酸外切酶活性引起的引物降解，PV2 DNA 聚合酶要最后加入到反应体系中。请注意，以下的操作步骤与其它标准聚合酶不同，因此以下推荐的反应条件为最佳反应条件。

组分	20 µl 反应体系	50 µl反应体系	终浓度
5X PV2 缓冲液	4 µl	10 µl	1X
10 mM dNTPs	0.4 µl	1 µl	200 µM
10 µM 正向引物	1 µl	2.5 µl	0.5 µM
10 µM 逆向引物	1 µl	2.5 µl	0.5 µM
模板 DNA	可变	可变	< 250 ng
DMSO (optional)	(0.6 µl)	(1.5 µl)	3%
PV2 DNA 聚合酶Polymerase	0.2 µl	0.5 µl	1.0 U/50 µl PCR
ddH2O	to 20 µl	to 50 µl

注意：PCR反应建立后，将反应物吸打混匀，短暂离心将液体收集到管底。如果使用的PCR循环仪没有加热盖，可在样品上覆盖矿物油。

将PCR管从冰上转移至预加热（变性温度98°C）的PCR仪上开始热循环

循环步骤	温度	时间
预变性	98°C	30 s
25-35 Cycles	98°C 45-72°C 72°C	5-10 s 10-30 s 15-30 s/1kb
终延伸	72°C	5-10 min
Hold	4-10°C

 

PCR扩增反应指南

• 模板: 

使用高质量、高纯度的DNA模板可以提高PCR反应的成功率 。50ul反应体系建议的DNA模板用量建议如下：

DNA	Amount
基因组	50 ng–250 ng
质粒或病毒	1 pg–10 ng

如果DNA模板来自于cDNA合成反应，DNA的体积应该不超过总的反应体积的10%。

• 引物:

寡核苷酸引物长度一般为20~40nt，GC含量一般为40~60%，可以使用Primer 5等软件设计分析引物 。使用PV2 DNA聚合 酶时 ，每条引物的终浓度为0.2~1μM，建议用量是0.5μM。

• Mg²⁺ 和添加剂:

由于PV2 DNA 聚合酶是一种镁离子依赖型酶，故Mg²⁺浓度对其有着关键作用。在1X PV2缓冲液中Mg²⁺终浓度为1.5 mM。过量的Mg²⁺能稳定DNA双链结构，阻止DNA完全变性，以稳定由于引物非正确结合模板位点引起的假阳性。最佳Mg²⁺浓度应还受总dNTP的浓度、特定模板以及样品缓冲液成分影响。如果引物或模板中含有像EDTA或EGTA等螯合剂时，则应提高Mg²⁺的浓度。如需进一步优化， 可以使用MgCl₂按0.5 mM浓度逐步提升调整。

对于复杂模板，如高GC含量的序列和带有复杂二级结构的序列，可以加入DMSO等添加剂提高反应效率。建议DMSO的终浓度为3%，也可以以2%的浓度递增优化。需要注意的是由于DMSO可以降低引物的Tm值 ，因此如果DMSO浓度很高， 则需要降低退火温度。PV2  DNA聚合酶也可以与其它添加剂兼容，如：甲酰胺或甘油。

• dNTP:

dNTP的反应终浓度通常是各200 μM 。在使用PV2 DNA聚合酶时，不推荐使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。

• PV2 DNA 聚合酶:

我们推荐PV2 DNA聚合酶的使用浓度是20 U/ml (1.0 U/50 μl 反应体系)。根据扩增子的长度和困难程度，可以对PV2 DNA聚合酶在10–40 U/ml (0.5–2 U/50 μl 反应体系) 之间进行优化。50 µl反应体系中PV2 DNA聚合酶的用量不要超过2 U，尤其当扩增子的长度大于5 kb时。

• 缓冲液:

随酶提供5X PV2缓冲液。当进行高保真扩增时该缓冲液是默认的推荐缓冲液。

• 变性:

我们推荐大多数模板的预变性温度及时间是98°C 与 30s。对于需要延长变性时间的模板，预变性时间可以增加到3min。

在 PCR过程中，变性时间越短越好，大多数模板通常在98°C变性时间是5~10s即可。

• 退火:

与其它PCR聚合酶相比PV2 DNA 聚合酶需要较高的变性温度 。PV2 DNA 聚合酶具有稳定引物和模板杂交的性能，当引物长度大于20nt时，退火温度在最低Tm的基础上加3°C复性10~30s；但当引物长度小于或等于20nt时，退火温度为最低的Tm。可以根据需要建立温度梯度去寻找引物和模板结合的最适温度，这个梯度温度以最低的Tm逐步提升到模板延伸温度（两步PCR）。

对于Tm较高的引物用两步PCR法可以不需要复性这一步。

• 延伸:

延伸过程在72°C进行，延伸时间取决于扩增片段的长度和模板复杂度，复杂度较低时可用15s/Kb的延伸时间；复杂度较高的基因组DNA模板，延伸时间则应为30s/Kb。对于有些cDNA模板，延伸时间可增加到40s/Kb。 

• 循环数: 

通常25~35个循环可以产生足够的PCR产物。

•  两步法PCR:

当引物的退火温度≥ 72°C 时建议使用两步法进行PCR扩增。

常规的两步法PCR热循环条件如下：

循环步骤	温度	时间
预变性	98°C	30 s
25-35 个循环	98°C 72°C	5-10 s 15-30 s/ kb
终延伸	72°C	5-10 min
Hold	4-10°C

•  PCR产物:

使用PV2 DNA聚合酶扩增的产物为平末端，如果产物用于克隆，建议使用平末端连接。如果需要进行T/A克隆，在加A之前需要纯化DNA，因为PV2  DNA 聚合酶会降解产生的突出端。