单条shRNA构建
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- 2022-12-14 15:56:35
北京欧林格生物科技有限公司
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shRNA的构建：
一 简介
构建shRNA表达载体，实现shRNA在细胞中稳定表达，能够弥补瞬时转染持续时间短的不足。
慢病毒表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3’端形成 1~4 个 U。U6 和 H1RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～19nt RNA 和～50nt RNA 茎环结构（stem loop）。在 siRNA 表达载体中，可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于 RNA聚合酶Ⅲ启动子和 4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有 1~4 个U. 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA。
这一段话本来不想贴的，但是大家都贴，我也就贴上来了，其实我是抄的。。。。。
二 常用载体图谱：
这个载体真的很牛X的，我来说说牛X的地方
a 既有荧光标记又有抗性筛选标记，双标啊。
1） puro是最好用的抗生素没有之一（BSD太贵，不建议用带BSD的载体）
2）ZsGreen这个荧光标签是真的亮，在荧光显微镜下，看一个个细胞被点亮，就像看到30年前夜空的星星（暴漏年龄）
3）ZsGreen和puro由aT2A隔开，这设计太TMD精简了，大家都知道慢病毒包装载体越大出毒越低，我们这个载体出毒就没低于8次方的
b U6启动子，shRNA发夹结构后面用连续的TTTTT结尾，也就是转录到这里就停停停下（转录的太多了会多一堆乱七八糟说不清楚的东西）
如果靶点前面是A，T, C开始的我们会多添加一个G，据说有助于转录。
c 我司还有Cherry/BFP的载体/无荧光的供您挑选。
这个是因为大家后面可能会做免疫荧光等实验，可以根据需要自行选择。
三靶点设计
这个大家百度一下，太多文章讲了，我们就不讲了。
四 关于构建
1）这个一般就是合成一对引物（59bp最经济实惠，怎么设计的刚好59bp您可以Q上联系我），退火，连接。easy的很。。。
引物合成一般脱盐纯化就可以（土豪表示page 毫无压力，土豪土豪我们做PY吧）
引物退火：把水烧开，退火的双链煮沸5min自然降至室温 百分百没问题
2）酶切载体，酶切好坏是载体构建的关键步骤。为啥尼，引物公司给合成的，大部分没有质量问题。T4连接酶，Thermo,全式金，生工的我们都用过，
质量都OK，自己保存不当出了质量问题的除外。所以大部分童鞋引物回来搞不定构建都是载体没切好。那么怎么切好载体呢，在这里我就提一点，
就是买同一家的酶，推荐NEB和thermo的，我们比较喜欢FD快切酶，15min切好，妥妥的。
3）感受态。商用的感受态一般来讲效率都还可以。QSJ，WD，ZM等公司的都可以。
对于shRNA构建来讲，一条shRNA 半支感受态足以
五 关于鉴定
shRNA的构建，我司根据自己的经验，可以PCR/酶切/测序鉴定两种方法。
1）PCR鉴定
由于插入的片段不大，只有59bp,在载体上设计引物 ，扩增的产物和空载体一起电泳，需要2%-3%的琼脂糖凝胶电泳，140V，电泳1h才能分开大小
2）酶切鉴定
发夹结构的loop环可以设计CTCGAG ,用XhoI的酶，能切开的自然就是构建成功的。
3）测序鉴定
构建成功率高的可以直接把板子给测序公司，挑克隆测序鉴定。
现在一代测序公司竞争压力太大 8块，10块，12块，15块都有，所以经常会遇到测不过去的情况。所以选择一个好的测序公司能节省好多时间
好了，现在是广告时间，欢迎选择我们公司构建shRNA，速度块，质量好，价格美丽
您只需提供siRNA的靶序列或者基因信息给我们，7-10天就可以拿到测序正确的shRNA克隆。加急可以5天交付PCR/酶切鉴定的 shRNA菌液
服务流程：
1）mRNA序列分析；
2）引物设计及合成；
3）单链互补引物退火；
4）将片段克隆至载体；
5）测序以确保插入序列正确性；
客户提供：
目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat种属）；
我们提供：
1） 构建好的表达载体和相应的甘油菌；赠送阴性对照甘油菌；
2） 测序报告 ；
质量保证：
针对某靶基因设计的3条shRNA序列，在转染效率>80％的前提下，我们保证至少有1个克隆可以达到70％转录水平的沉默效率。
