T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3'-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口，以上反应均需消耗ATP。

1）DNA片段和载体DNA的连接；
2）DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接

随酶附带10×T4 DNA Ligation Buffer及独特配方的2×Quick Ligation Buffer提供给您更多的选择：使用10×T4 DNA Ligation Buffer，16℃过夜连接可获得最高的连接效率；而使用2×Quick Ligation Buffer在室温(25℃)下，仅需5分钟即可完成粘性末端或平末端DNA片段的连接反应。

-20℃。

在20μl的连接反应体系中, 6μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时, 有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个单位。

经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带，PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

粘性末端的连接反应：插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2～6:1之间最好，低了会导致较低的连接效率，高了则会导致多个片段插入。摩尔比请按载体与插入片段DNA浓度及分子大小来计算。
平末端的连接反应：平末端的连接反应与粘性末端相比反应较慢(其Km值约为粘性末端的100倍)。进行平末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到粘性末端量的2～5倍左右。
向粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果(0.05～0.1 μg/μl以上)。
反应温度：该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1～2小时左右的话也可在室温下进行反应。
抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg²⁺，因此螯合Mg²⁺的EDTA的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。