菌株基因编辑技术服务

一、利用同源基因序列的交换的实验步骤：

  一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统进行基因敲除:首先构建同源交换位点(AES)，随后将其整合到特定菌株噬菌体基因组中，获得噬菌粒(phasmid);将噬菌粒导入特定菌株，获得整合有同源交换位点的重组噬菌体，经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体，对特定菌株进行转染;将转染后的特定菌株涂布到含潮霉素抗性的固体培养基上，37°C培养 4-5 周，挑取单克隆，通过 PCR 等方式进行验证。

主要原理是同源重组的方法，利用同源基因序列的交换将目的基因敲除。

（1）找一个温敏型质粒；

（2）用PCR方法扩增靶向基因两侧各200bp片段，并要加上适当的酶切位点；

（3）筛选一个合适的抗性基因；

（4）将抗性标记连接与两个片段的中间，然后与温敏质粒连接；

（5）转入菌株感受态中；

（6）通过合适的抗性筛选筛选阳性工程菌株。

二、服务流程：

1.客户提供敲除基因编号；

2.构建同源臂及包装噬菌体；

3.噬菌体感染菌并验证阳性克隆；

4.提交特定菌株基因敲除菌株（液体）及实验相关的引物、测序结果、详细的结题报告。

服务周期4-6个月。

三、基于CRISPR/Cas9平台的菌基因组改造实验步骤：

CRISPR/Cas9是一种在特定目标位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引导下对特定基因进行剪切，

从而达到基因敲除、敲入以及修饰、调控等目的。

敲除：与常规的shRNA敲低不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特异性的在基因组水平造成碱基的缺失或插入（INDEL），

造成原有基因表达框的破坏，造成靶基因蛋白水平的完全敲除。

敲入：与常规病毒介导的过表达不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因组位点切割后，可在带有同源臂的修复模板引导下，

将待敲入的基因插入到目的位点，不同于病毒介导的随机整合。

泰斯拓生物科技推出CRISPR方法进行菌基因组改造服务（包括基因敲除、定点突变、定点插入外源序列等）。相比于传统的基因敲除方法，该方法速度快，无痕；非常便于后续的实验研究。