脑和肝脏类器官的共培养

A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalentsfor long-term substance testing

脑和肝脏类器官的共培养

Abstract

用于药物开发的体外和动物试验未能模拟人体全身器官的复杂性，因此，往往不能准确预测药物毒性，导致临床研究中的高耗损率(Paul et al.， 2010)。人类和实验动物之间的系统发育的差距是巨大的，这影响了神经保护类药物疗效的动物数据到人体实验的可转移性。因此，许多在动物身上表现出希望的神经保护疗法在转移到人类身上时并不成功(Dragunow, 2008;Gibbons and Dragunow, 2010)。我们提供了一种多器官芯片，能够在组合介质电路中维持来自各种细胞来源的3D组织，从而弥补了系统和人体测试中的差距。在多器官芯片中，人类人工肝显微组织和人类神经球在微流道液体中，超过两周的稳态共培养成功地证明了其长期培养的可行性。每日测量乳酸脱氢酶活性和免疫荧光终点染色证明了组织的活力和分化的细胞表型的维持。此外，培养组织的乳酸产量和葡萄糖消耗值表明，在共培养6天后达到了稳定状态。在多器官芯片中培养两周后，神经球仍保持分化的神经元，神经元标记物-微管蛋白和微管相关蛋白-2的qPCR和免疫荧光证实。此外，两种不同浓度的2,5-己二酮反复暴露于神经毒性物质的两周毒性试验诱导了神经球和肝脏显微组织内的高凋亡，这从培养基中乳酸脱氢酶活性的强烈增加可以看出。将共培养物暴露于2,5-己二酮的主要发现是，不仅可以区分两种不同剂量的毒性，而且与多器官芯片上各自的单组织培养物相比，共培养物对这种物质更敏感。因此，我们在此提供了一种新的体外工具，可以在未来更准确地预测药物在临床研究中的安全性和有效性。

Introduction

新药的开发非常昂贵、耗时，而且只有少数几种药物经得起长时间的测试。动物实验往往无法预测新药的效果，因为实验室动物和人类之间的系统发育距离太大(Bailey等人，2013;Dragunow, 2008)。大量的实验动物用于物质测试不仅昂贵和费力，而且在道德上也存在问题。因此，寻找新的技术在早期阶段评估潜在的候选药物是至关重要的。微流控培养装置将人体显微组织在体内平衡的稳定状态下结合在一起，很可能成为解决这一测试难题的一种转化方案。

目前，能够在体内模拟人类情况的微流控平台非常少(Hwan等人，2009;Zhanget。,2009)。这些系统的缺点大多是外部泵和外部介质容器，导致高的液组织比。因此，组织之间的串音是不确定的。此外，大多数这些微流控系统的物质或药物暴露时间在24至72小时之间，只有少数能工作7天(Marx等，2012)。然而，根据经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and development)对动物进行化学物质和化妆品毒性测试的指导方针，动物必须接受28天的反复剂量试验。在这里，我们评估了我们实验室开发的微流控多器官芯片(MOC)平台是否能够在长时间培养期间共培养神经球和肝球。该MOC基于一个物镜载玻片的区域，加载一个上面的微流泵，并能够连接两个不同的类器官。微流泵确保了以可变流量通过组织培养室的稳定的长期介质循环，可调节以模拟相应组织中血流依赖性的机械剪切应力(Schimek et al.， 2013)。组织培养室和连接通道是透光的，因此可以支持活体组织成像。研究表明，MOC能够支持由分化的HepaRG细胞和人肝晚期钢细胞组成的肝球状细胞，以及分化的神经球，来源于nt2细胞系，在复合培养基中稳定培养数周。免疫荧光染色和所选标记基因的qRT-PCR结果表明，细胞的分化表型得到了保留。此外，系统布局和芯片设计支持重复物质暴露的安全性或有效性测试分析开发。

在为期两周的毒性试验中，2,5-己二酮被用来研究它对组织的毒性作用。在人的肝脏中，正己烷可以通过解毒途径代谢为1-己醇或3-己醇，也可以通过生物活化途径代谢为2-己醇。2-己醇在许多氧化步骤中进一步代谢为2,5-己二酮和其他代谢物(Yin et al.， 2013)。这些物质被分配到血液中，到达其他器官，如肾脏和大脑。2,5-己二酮是导致神经毒性的主要成分，因为与其他代谢物相比，它在人体内滞留时间最长。2,5-己二酮可以通过吡咯加合物的形成和由此产生的共价交联改变神经纤维的结构(Heijink et al.， 2000)。神经毒性效应已经在实验室动物和细胞系的不同研究中得到证实(DeCaprio et al.， 1988;Ladefoged等人，1994年)。然而，2,5-己二酮暴露于神经元细胞(NT-2- n, SK-N-H)和非神经元细胞(NT-2) 4小时没有显示任何细胞毒性，但暴露于32mm 2,5-己二酮24小时对两种细胞类型都有毒性作用(Woehrling等，2006)。

Material and Methods

2.1 Cell sources and maintenanceCell

细胞培养成分从PAA实验室购买(GE Healthcare Europe GmbH, Vienna, Austria)，并在37◦C和5%的二氧化碳HepaRG培养基中培养，除非另有说明。HepaRG细胞来自Biopredic international (Rennes, France)，并按照Griponet al.(2002)的描述进行维护。简单地说，细胞培养在HepaRG培养基中，包括添加10% (v/v)胎牛血清(FBS)、100单位ml - 1青霉素、100 g ml - 1链霉素、5g ml - 1人胰岛素、2 mM l-谷氨酰胺和5 × 10 - 5M半丁氢化可的松(Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, USA)。未分化的细胞在75 cm2tis-sue培养瓶(Greiner Bio One, Germany)中以2 × 104个细胞cm−2的播种密度保存两周。分化的诱导是通过将细胞在生长培养基中保持两周，使细胞达到融合而开始的。含2% (v/v)二甲基亚砜(DMSO; Carl RothGmbH, Karlsruhe, Germany)随后又被添加了两周。人肝星状细胞(HHSteC)及其培养补品购自美国卡尔斯巴德科学细胞研究实验室(Carlsbad, CA, USA)。细胞接种于5 × 103cells cm - 2中，置于聚l-赖氨酸包覆的75 cm2组织培养瓶中，按照制造商说明进行星状细胞培养基中保存。每两到三天换一次币。细胞在90%合流时被收集以供进一步使用。NTera-2 / cl。D1 (NT2)细胞来自美国型细胞培养标本(ATCC)，并按照Brito等人(2007)的描述进行维护。简单地说，未分化的细胞在4-4.5 × 104cell cm - 2in DMEM的播种密度下常规培养，添加10% (v/v)胎牛血清和1% (v/v)青霉素链霉素(P/S; Invitrogen)。

2.2. Preparation of neurospheres and liver microtissues

神经球的制备方法如inSerra等人(2009)所述。简而言之，将未分化的NT2细胞悬液置于装有球叶轮的125 ml硅烷化旋转容器(Wheaton公司)中，在75 ml DMEM、10%胎牛血清、1% P/S浓度下培养7 × 105cell ml−1细胞。第2天，加入50毫升新鲜培养基。3天后，用10 M维甲酸(RA)孵育3周诱导分化。在分化期，每两到三天进行50%的培养基交换，DMEM中含有10%胎牛血清、1% P/S和20 uM RA。

如Wagner等人(2013)所述，进行肝脏显微组织的制备。简而言之，将20 l细胞悬液(含4.8 × 104HepaRG细胞和0.2 × 104原代人肝星状细胞(HHSteC)加入Perfecta3D®384孔悬液滴孔(3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA)。在2天的悬滴培养后，球体转移到超低附着24孔板(康宁，洛威尔，MA，美国)，每孔最多20个球体。

图1所示。多器官芯片。(A)包含容纳两个微流控电路的pdms -玻璃芯片的设备的分解图。(B)神经球和肝脏显微组织在MOC内单次培养和共培养的实验建立(n = 4)。

2.3. Multi-organ chip manufacturing and cultureFabrication

MOC的制造过程如Wagneret al.(2013)所述。简而言之，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)复制成型后，形成一个单独的2毫米高的PDMS层，其中包含相应的微流控通道系统，并使用低压等离子体氧化(Femto;Diener, Ebhausen, Germany)将其永久地连接到一个玻璃显微镜载玻片(Menzel, Braun-schweig, Germany)上。PDMS层由两个培养细胞的隔间和三个泵膜(厚度:500 m)组成。泵浦频率为1.5 Hz，压力为0.6 bar。肝脏显微组织(每个插入20个球体)和神经球(每个插入80个球体)分别置于350 uL肝细胞培养基中，分别装入每个MOC回路的单独培养室进行共培养。额外的moc仅装载肝脏显微组织或神经球进行比较(图1)。在前5天，每隔12小时采用40%的介质置换率。之后，每24 h采用40%的交换率。每天收集培养基样品用于乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖和乳酸分析。实验在共培养的第14天停止，MOCs组织冷冻在在−80◦C进行免疫组化分析和RNA提取。MOC共培养和各自的单组织培养用两剂2,5-己二酮(≥98%)(16mm和32mm) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在HepaRGmedium中稀释，从第6天开始。之前有报道称32 mM浓度在24 hof给药后会导致NT2细胞毒性(Woehrling等人，2006年)。以不含任何物质的HepaRG培养基为对照。