NEJM发文报道可用于诊断急性心肌炎的新型microRNA生物标志物
背景介绍
心肌炎可由不同因素引起，例如感染性病原体、毒素、药物和自身免疫病等。心肌炎可自愈，可引起心源性猝死，也可发展为扩张型心肌病。长期以来，由于许多患者难以得到准确的诊断，因此领域内对心肌炎的实际患病率仍不清楚。
当前，心肌炎的确诊通常需要进行冠状动脉造影或计算机断层扫描，再经过心脏磁共振成像（MRI）证实是否符合Lake Louise标准。然而，并非所有医疗中心都拥有上述的诊断设备。此外，心内膜心肌活检是诊断心肌炎的金标准，但这种方法通常用于重症病例。因此，目前临床上仍然缺乏可早期诊断急性心肌炎的可靠、便捷的诊断工具。
miRNA已被广泛研究并成为多种疾病，尤其是心血管疾病的新型生物标志物，那么是否存在一种可鉴别诊断急性心肌炎和心肌梗死的新型miRNA？为了回答这个问题，西班牙国家心血管研究中心Pilar Martín领导的研究团队在国际医学顶尖期刊NEJM发表了题为“A Novel Circulating MicroRNA for the Detection of Acute Myocarditis”的研究性文章，报道了一种可用于诊断急性心肌炎的新型miRNA。
文章发表在NEJM
主要研究内容
急性心肌炎和心肌梗死中的Th17特异性应答
已有研究表明，循环T细胞在心肌炎和心肌梗死患者中均发生明显改变。其中心肌肌球蛋白特异性的17型辅助性T（Th17）淋巴细胞在心肌炎和扩张型心肌病发生过程中及病毒性心肌炎患者生成抗心肌抗体过程中起核心作用。
首先，研究人员构建了自身免疫性心肌炎或心肌梗死小鼠模型，通过评估经典的心肌损伤标志物，包括心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶MB和乳酸脱氢酶等水平确定小鼠模型成功构建。通过对循环T细胞进行分析，发现Th17细胞的数量在心肌炎或心肌梗死后14日显著增多，但在心肌梗死后的第3日或第7日时并未显著增多。这一数据表明Th17细胞可能并不是心肌梗死中心肌损伤急性期的特征，而是特异性表征心肌炎中的心肌损伤急性期。
随后，研究纳入了42例急性心肌炎患者、45例ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者、45例非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者和80例健康对照的临床数据，同样发现急性心肌炎患者的Th17细胞显著增多，这凸显了Th17细胞在心肌炎患者中的关键作用。综上所述，通过分析从心肌炎和心肌梗死小鼠和患者获得的循环T细胞，该研究证实Th17细胞是心肌炎急性期心肌损伤的特异性特征。
图1. 急性心肌炎和心肌梗死模型的构建及循环中Th17的特异性应答，图片来源: NEJM
心肌炎小鼠血浆中的mmu-miR-721的鉴定和检测
为鉴定出对心肌炎具有特异性的miRNA，研究人员对发生心肌炎或心肌梗死小鼠的CD4+ T细胞和17型辅助性T（Th17）细胞进行了miRNA微阵列分析和qPCR分析。结果发现，与发生中度心肌炎的小鼠细胞相比，发生重度心肌炎小鼠的Th17细胞中的mmu-miR-721是上调幅度最大的miRNA，qPCR分析也证实了这一结果。
图2. 心肌炎小鼠血浆中的mmu-miR-721的鉴定，图片来源: NEJM
研究团队检测了自身免疫性心肌炎小鼠血浆中mmu-miR-721的表达，以及急性心肌梗死小鼠血浆中mmu-miR-483-5p的表达。结果表明，在CD69敲除小鼠(重度心肌炎小鼠) 中，mmu-miR-721的表达显著增加，并且循环mmu-miR-721的表达趋势与循环Th17细胞数量的增减相似。
图3. 心肌炎小鼠血浆中的mmu-miR-721的检测，图片来源: NEJM
mmu-miR-721人类同源物的确定、克隆和验证
为确定mmu-miR-721的人类同源物，研究团队在人类和其他哺乳动物基因组中筛选同源序列，并经过克隆筛选确定了与mmu-miR-721相同的18核苷酸序列，该序列位于人类基因组的第8条染色体，同时具有高度保守性，被命名为hsa-miR-Chr8:96。
随后，研究团队克隆了hsa-miR-Chr8:96的前体，并与Argonaute-2或IgG亚类1进行RNA免疫共沉淀实验，qPCR分析结果表明克隆的片段能够被加工为成熟的miRNA。为进行功能验证，研究人员在荧光素酶双报告载体中克隆了hsa-miR-Chr8:96的反向互补序列，并发现其可抑制心肌炎患者外周血上清中的荧光素酶活性，该实验证明hsa-miR-Chr8:96是有功能活性的成熟miRNA。
图4. mmu-miR-721人类同源物的确定、克隆和验证，图片来源: NEJM
急性心肌炎患者中同样存在hsa-miR-Chr8:96
研究团队对临床队列的血浆样本进行了qPCR分析，以确定miRNA的表达情况。整体结果表明，心肌炎患者血浆中hsa-miR-Chr8:96的表达显著高于心肌梗死患者或健康对照。通过ROC曲线确定血浆中hsa-miR-Chr8:96的表达在心肌炎诊断特异性方面的效果。分析结果显示，与心肌梗死患者相比，ROC曲线下的面积为0.927；与健康对照相比，ROC曲线下的面积为0.988，表明hsa-miR-Chr8:96在心肌炎诊断特异性方面具有很好的表现。
除此之外，研究团队还使用其他队列进行验证，结果证实，与心肌梗死患者相比，hsa-miR-Chr8:96在心肌炎患者血浆中出现特异性高表达，包括通过活检证实的心肌炎患者。
图5. hsa-miR-Chr8:96在急性心肌炎患者中的诊断表现，图片来源: NEJM
研究总结
总而言之，在该研究中，研究人员从小鼠模型（包括实验性自身免疫性心肌炎和病毒性心肌炎）出发，鉴定了一种可作为心肌炎标志物的新型miRNA (mmu-miR-721)，并确定了其人类同源物 (hsa-miR-Chr8:96)。多种临床队列数据显示，血浆中的hsa-miR-Chr8:96在鉴别心肌炎和其他疾病方面具有优良表现，弥补了当前诊断心肌炎的不足。
参考文献 ：
1. Blanco-Domínguez R, et.al. A Novel Circulating MicroRNA for the Detection of Acute Myocarditis. N Engl J Med. 2021 May 27;384(21):2014-2027.
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3. Cruz-Adalia A, Jiménez-Borreguero LJ, Ramírez-Huesca M, et al. CD69 limits the severity of cardiomyopathy after autoimmune myocarditis. Circulation 2010; 122:1396-404.
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