蛋白表达实验过程可能遇到的常见问题分析

一、蛋白不表达或表达量很低？

1.选择正确的表达载体和表达菌株

T7启动子的载体应选用BL21（DE3），BL21（DE3）pLysS，Transetta（DE3）等菌株。非T7启动子的表达载体应选用BL21表达菌株。

2.尝试不同的表达载体与菌株

3.表达条件的优化

选择不同的培养基。对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%-0.5%），可以明显提高表达量。

较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。

细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD600值监测生长状态。对于大部分蛋白，应在菌株的对数生长期（OD600=0.5）进行诱导。

二、目的蛋白大小不正确？

蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白，从而准确判断蛋白大小。确认蛋白表达是否完整，蛋白是否提前终止表达。若形成二聚体甚至多聚体，可以通过加热变性蛋白打开二硫键（加入DTT、β-ME等还原剂）等手段，破坏次级结构，准确判断分子量大小。