重组腺病毒（包装）与应用​

一. 腺病毒与重组腺病毒

腺病毒（adenovirus，Ad）是一种球形、无包膜、直径约70～80 nm颗粒病毒。其基因组为36kb大小的双链线性DNA，两端各有长约100 bp的反向重复序列，编码30多种“调控蛋白”。腺病毒表面的纤毛头节区（Fiber Knob）通过与细胞表面的柯萨奇腺病毒受体（CAR）介导的细胞内吞作用进入细胞，而后腺病毒基因组转移至细胞核内，游离于染色体外。

                  图1 腺病毒感染细胞示意图

重组腺病毒（AdV）是一种经基因重组改造复制缺陷的腺病毒载体系统，目前常用的腺病毒载体主要基于人腺病毒5型（Ad5）改造的。近年来，重组腺病毒作为基因转移或基因治疗载体，已被广泛用于基础研究、疫苗载体及基因治疗研究领域。

重组腺病毒（包装）优势：

①　宿主细胞范围广，致病性低，安全性高；

②　能有效进行增殖，滴度高，适用于基因治疗；

③　载量大，可容纳6kb外源DNA；

④　感染效率高，1-2天即可表达，是研究原代细胞及悬浮细胞基因表达的最佳选择；

⑤　不整合到基因组中，不干扰其他宿主基因。

二．重组腺病毒（包装）系统

重组腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种，一种在细菌（BJ5183）中重组，为AdEasyTM腺病毒重组系统，另外一种在QBI-293A细胞中重组，为AdMax腺病毒重组系统。赛尔所采用的系统主要是AdEasyTM腺病毒重组系统，主要由线性化的穿梭质粒（pAdTrack-CMV或者pAdTrack-U6）和辅助质粒（pAdEasy）在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，卡那抗性筛选重组子，并酶切鉴定，线性化后转染293A细胞制备腺病毒。

三．重组腺病毒（包装）实验主要过程

重组腺病毒包装主要分为三部分：

                      图2 重组腺病毒流程示意图

1. 腺病毒穿梭质粒构建：

①　过表达目的基因：将目的基因通过适当的酶切位点（如BglII、KpnI、XhoI、HindIII等）构建在pAdTrack-CMV上，并进行穿梭质粒的酶切鉴定及测序确定；

②　敲降目的基因：根据目的基因设计合成编码shRNA的DNA片段，通过SalI-BglII构建在pAdTrack-U6上，将穿梭质粒进行酶切鉴定及测序确定；

③　测序正确后大量扩增并纯化，保存于-20℃；

④　质粒有效性验证： 利用Western blot或者RT-qPCR定量检测目的基因的表达水平。

2. 腺病毒重组质粒的构建：

①　穿梭质粒线性化：PmeI单酶切pAdTrack-CMV/U6后，运用酚氯仿进行抽提回收线性化质粒；

②　将其转化至含有辅助质粒pAdEasy的感受态菌(BJ5183)中，铺至含卡那(50～100ug/ml)的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜后挑取7-8个单克隆摇菌扩增，碱性裂解法提取质粒，PacI单酶切，0.7％琼脂糖凝胶电泳观察重组子构建是否正确。

图3 重组子确切鉴定电泳图

（1-4、6-7号重组子构建成功）

③　大量提取重组质粒，PacI单酶切，酚氯仿抽提回收，准备转染293A细胞。

3. 重组腺病毒包装：

①　T25细胞培养瓶中接种1×10⁶个293A细胞，继续培养24h，待融合度达60-70%左右进行转染。

②　利用线性化的重组质粒进行细胞转染，次日换液。

③　7-10天后将细胞转移至50mL离心管中，离心后将细胞重悬于2ml HBSS或PBS中。甲醇冰浴，37℃冻融3次。短暂离心后收集上清-80℃保存。

④　病毒上清感染实验：利用上述病毒上清感染293A细胞。

⑤　如步骤3方法收集病毒，并按上述步骤大量扩增病毒。

四．重组腺病毒（包装）应用（感染细胞效果）

赛尔采用的重组腺病毒系统含EGFP报告基因，根据实验要求重组包装的腺病毒在感染目的细胞后，可在荧光显微镜下观察EGFP荧光确定其感染进入细胞的程度；或用于动物体内实验时，可在动物活体成像仪上观察EGFP荧光强度。同时进行相关功能表型或分子功能学的研究。

                              图4 重组腺病毒感染细胞效果（右侧为明场）

五．重组腺病毒应用案例

案例一

Paired related homeobox protein 1 regulates PDGF-induced chemotaxis of hepatic stellate cells in liver fibrosis. Jin G et al. Lab Invest.2017 Sep;97(9):1020-1032.

血小板衍生生长因子(PDGF)/PDGF β受体(PDGFβ r)轴的激活在肝纤维化中起着关键作用。然而，调控PDGF信号的机制尚未被阐明。本研究表明，Prrx1通过调控金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达参与了PDGF依赖性肝星状细胞(HSCs)的迁移。PDGF通过激活ERK/Sp1和PI3K/Akt/Ets1通路提高Prrx1水平。在体内，腺病毒介导的Prrx1 shRNA可减轻硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型的肝纤维化。这些研究揭示了Prrx1作为造血干细胞中PDGF依赖的信号转导因子的作用，抑制其表达可能为肝纤维化的治疗提供一种方法。

图注：通过腹腔注射TAA(200mg/kg)，每周注射2次，注射6周以诱导SD大鼠肝纤维化，随后通过尾静脉注射Prrx1 shRNA 腺病毒或对照腺病毒 5×10⁹ PFU，每周1次，2周后处死，采用IHC检测纤维化肝脏中COL1A1、α-SMA、MPP2和Prrx1的表达。

案例二

Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy. Tachung Y. et al. Cell. 2017 Jul 27; 170(3): 548–563.e16.

肠道菌群与慢性炎症和癌变有关。化疗失败是结直肠癌患者复发和预后不良的主要原因。本论文研究了肠道菌群对结直肠癌患者药物抗性的调控作用。作者发现，梭杆菌（F. nucleatum）在化疗后复发患者的结直肠癌组织中含量丰富，并与患者的临床病理学特征相关。生物信息学和功能研究表明，梭杆菌促进了结直肠癌对化疗的耐药性。在分子机制方面，梭杆菌靶向TLR4和MYD88先天免疫信号传导和特异性microRNA，以激活自噬途径并改变结直肠癌化疗反应。

图注：选择4周龄的雄性BALB / c裸鼠进行结肠癌肿瘤模型的建立，将结直肠癌细胞（1×10⁷个SW480细胞或5×10⁶个HCT116细胞）皮下注射到每只小鼠的右腋窝中。皮下接种后6天，将小鼠随机分成不同的组进行不同的实验。根据分组在肿瘤内多点注射表达miR-18a/miR4802/ATG7/ULK1重组腺病毒和F. nucleum，每周2次，持续3周。化疗药物奥沙利铂则通过腹膜内注射给药，每周2次，持续3周。