分子诊断(NGS)标准品构建

（1）产前筛查和产前诊断：靶向区域基因组测序、大范围基因组测序、染色体非整倍性检测

（2）遗传病诊断

（3）肿瘤诊断与治疗

（4）植入前胚胎遗传学诊断

（5）病原微Th物检测

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根据《体外诊断试剂注册管理办法》（试行），体外诊断试剂可分为I类、II类、III类，其中II类、III类要求进行性能验证，国内现有的个体户诊断项目绝大多数属于此类。

性能验证的内容包括：精密度或重复性（定性和定量）、准确度（定性为方法学比较或与标准样品盘比较）、线性（定量）、可报告范围（定量）、检出限（定性）、参考区间（定量）、抗干扰能力等。

涉及人基因组的检验项目包含如下质控品：

① 阴性质控品：判断假阳性反应

② 阳性质控品：判断假阴性反应

③ 提取内对照：监测提取效率是否符合要求

④ 扩增内对照：监测扩增效率是否符合要求

· 免疫组织化学参考品

· 融合基因参考品（DNA层面、RNA层面、蛋白层面）

· 基因重排参考品（DNA层面、RNA层面、蛋白层面）

· 基因突变参考品（SNV、Indel）

· CNV参考品

· 低甲基化水平参考品

· 基因组不稳定参考品

（1）表征问题：标准品是否具有代表性，如何更具有代表性

（2）稳定性问题：是否满足批次内和批次间稳定性需求

（3）来源问题：获取途径的稳定性、可追溯性、可控性及可操作性

（4）成本问题：成本的可控性

| NGS标准品的分类与特点

（1）原始材料来源：临床样品；原始细胞株

（2）基因修饰材料来源

（3）不同标准品模型之间的比较

(1）随机修饰：VIRUS-FreeTM基因导入系统

优势：流程短，无需病毒包装；插入片段大小不受限制；表型稳定

劣势：需要高效的转导方式

案例：人结直肠癌细胞HCT116/GFP稳转细胞株 (转染24h 药筛3天后的荧光图片)

(2）定点修饰：基于CRISPR介导的基因编辑技术；适用于基因的定点缺失Del、定点插入Ins、定点突变SNV、拷贝数变异CNV和基因重排等。

案例：293T细胞EGFR基因V769_D770insASV点突变

定点突变方案：通过CRISPR介导的同源重组技术进行定点突变p.V769_D770insASV (c. 2307_2308 ins GCCAGCGTG)

（1）混合克隆 → 单克隆

（2）高代次细胞株 → 低代次细胞株

（3）病毒法 → VIRUS-FreeTM基因导入系统

（4）随机插入 → 定点修饰

（5）单独构建 → All in one