提取大鼠肾小球系膜原代细胞

肺动脉平滑肌的原代分离是研究其结构和功能的基础，操作简单，重复性好的分离方法可以为其研究提供帮助。目前主要的分离方法为组织贴壁法和酶消化法，其中组织贴壁法为肺动脉平滑肌分离常用方法。

组织贴壁法分离时需要注意以下几个问题：

1：组织块大小边缘密度翻面时间观察时间对原代细胞萌发的影响，对于贴块法的原代培养来源，由于细胞并非直接获得，而是从组织块边缘长出，其中有一“突破过程”，且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖，故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1 mm2大小组织块，有研究者认为认为组织块0.5~2 mm2范围内，大小影响不大，但如组织块超过2 mm²将增加细胞萌出的阻力。

2：组织块边缘整齐、光滑、密度亦对细胞生长起着重要作用。组织块边缘过度受损或毛糙不平及组织块密度过稀或重叠将使细胞很难萌出。剥除内膜、外膜时用力适中，避免机械拉伤，将镊子夹过处切去，剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作，保持边缘湿润。

3：组织块密度以中瓶（100 ml）铺放取自6~8只150~250 g大鼠肺动脉剪碎组织为宜，而小瓶（70 ml）则以3~4只为佳，且相同重量的大鼠，以月龄较小者为优。

4：翻面时间一般认为3~6 h，具体时间应根据上述影响因素摸索而定。一般5~7 d后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出，但5 d内不宜移动，以免贴壁的组织块脱落，脱落的组织块很难有细胞的萌出。

溶液配制

PBS溶液：600ml的ddH₂O中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g

KH₂PO₄，用HCl调节溶液pH至7.4，定容至1L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存。

提取方法：

• 取SD雄性大鼠2只，体重150-200g，戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后放入超净台内，75%酒精浸泡，10min；
• 无菌操作取出双肾，置于4℃不完全培养基中，撕去肾包膜，对半剖开肾脏，去除肾髓质，将肾皮质剁碎至1-2mm³大小；
• 用PBS液冲洗肾皮质，洗去血液后倒入重叠的三层不锈钢筛网，自上而下分别是80目、120目、200目，在上层用玻璃注射器内芯轻轻研磨，并不时用4℃PBS缓冲液冲筛，最后用吸管在200目晒面上收集肾小球，置于离心管内，1000rpm，离心6分钟，弃上清；
• 将上述方法收集到的肾小球加入5ml含哦。4mg/mlⅣ型胶原酶的不完全培养液，37℃消化10min，1000rpm，离心6分钟，弃上清，加入不完全培养液洗涤两次，10min，1000rpm，离心6分钟，弃上清；
• 用适量的完全培养液悬浮肾小球，吹打均匀，接种于接种于25cm²的培养瓶内，37℃，5%CO₂培养，5到7天后观察肾小球贴壁和细胞移除生长情况；
• 肾小球静置6-7天后第一次换培养液，待系膜细胞长满平底，互相融合后传代；