细胞培养所需的理化环境

细胞培养所需的理化环境

细胞培养是指在体外模拟体内环境，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程。而细胞体外培养不仅需要生长因子等营养物质，也需要时刻维持一定的理化环境。

1、pH 

动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，其pH维持在7.4时细胞生长最好，虽然不同细胞株之间差别不大，但一些正常成纤维细胞系在pH 7.4-7.7生长最好，而一些转化细胞可能在pH 7.0-7.4生长得会更好些。对于一些特殊细胞，可通过简单的生长实验、接种率分析或特异性功能分析来确定适宜的pH。对于大多数细胞而言，在pH高于7.7和低于6.5的环境中生长缓慢，在pH高于7.8和低于6.0时，细胞会迅速丧失活力。注意，当细胞生长至汇合点后，培养基的pH会降低，导致乳酸释放，细胞将迅速凋亡（不一定是pH下降所致，更可能是伴随着营养和生长因子的枯竭和毒性物质的积累）。在这种情况下，通常就需要进行细胞的传代培养。酚红是细胞培养基最常用的一种pH指示剂。在pH 7.4时，它呈红色；pH 7.0时，变成橘红色；pH 6.5时，呈黄色；pH低于6.5时，呈柠檬黄色；pH 7.6时呈紫红色。

2、CO₂和碳酸盐

空气中CO₂的浓度是0.04％，CO₂培养箱保持在2％～10％（通常是5％）。CO₂通常都以气体的形式溶解于培养基中，与HCO₃^-达到平衡，从而降低培养基的pH，CO₂的浓度越高，需要用于平衡的HCO₃^-越多，因此溶解的CO₂、HCO₃^-及pH之间是相互调节的：

H₂O+CO₂→H₂CO₃=H⁺+HCO₃^-            （2.1）

由于HCO₃^-与大部分阳离子作用的解离常数都很低，因此又导致了重新结合，使培养基保持酸性。增加大气中CO₂的最终结果是降低pH，所以需要通过增加碳酸盐的浓度来平衡溶液内的pH：

NaHCO₃⇌Na⁺+HCO₃^-              （2.2）

增加HCO₃^-的浓度可迫使反应式向左进行，直至pH 7.4时达到平衡。如果用其他碱性物质（如NaOH）来代替，最终结果是相同的：

NaOH+H₂CO₃⇌NaHCO₃+H₂O⇌Na⁺+HCO₃^-+H₂O     （2.3）

表1 碳酸氢盐、CO₂、HEPES之间的相互关系

*如果使用HEPES，就要减去相应的NaCl摩尔数，且必须检测渗透压

尽管碳酸盐缓冲系统在生理pH下的缓冲能力差，但由于它毒性小，成本低，对培养物有营养作用，所以它仍比其他缓冲系统使用得多，如Goods缓冲液（如HEPES、Tricine）。

丙酮酸盐可产生细胞内源性CO₂，使它们不用依赖于外源性CO₂，如HCO₃^-。Lcibovitz的L15培养基含有较高浓度的丙酮酸钠（550mgL），但不含有CO₂，并不需要提供CO₂气体。这种培养基的缓冲作用是通过相关的高氨基

酸浓度来实现的。由于它不需要CO₂，经常适用于运送组织样品。

总而言之，如果使用开放式的培养瓶培养细胞，需要在含CO₂的气体环境中孵育，CO₂的浓度与培养基中碳酸氢钠的量可达到平衡。如果细胞处于中高密度（≥1x10⁵个/mL）或生长于密闭的培养瓶中，就不需要提供CO₂气体，同时培养基中的碳酸氢钠应保持在低浓度（约4mmol/L），而当细胞处于低密度状态（如克隆化培养）或进行某些原代培养时，必须在密闭的培养瓶中加入CO₂。在需要通气的时候，可拧松瓶盖或使用一种CO₂可渗透的瓶盖，这样既可与CO₂达到平衡，也可在高酸性时使CO₂逸出。

3、缓冲作用

培养基在以下两种情况下都能起到缓冲作用：①打开培养皿，这时CO₂逸出引起pH升高；②转化细胞系在高细胞浓度时CO₂和乳酸过量产生，pH下降。为了稳定pH值，可以加入缓冲物。尽管碳酸盐缓冲液在生理pH范围的缓冲能力很弱，但由于它的低毒性、低价格及营养方面的益处，仍然比其他缓冲液使用得多。HEPES是一种pH在7.2-7.6时缓冲能力较强的缓冲液，使用浓度是10mmol/L或20mmol/L，HEPES有毒性，价格也比较高。已知在有外源性CO₂存在的情况下，HEPES的浓度必须是碳酸盐浓度的两倍才能保证足够的缓冲力。

4、氧气

气相中另外一个重要的成分是氧气。氧气是细胞呼吸和糖酵解的重要来源，细胞主要利用溶解的O₂，而溶解的O₂可能导致自由基水平的升高，从而对细胞产生毒性。因此可以在培养基中加入自由基清除剂，包括谷胱甘肽、巯基乙醇或二硫苏糖醇等。甚至有些培养箱还可以通过增加氮气的比例来控制O₂和CO₂浓度。

培养物对氧的需求是不一样的，主要差别存在于器官培养与细胞培养。大气环境或低氧压力条件对于大部分细胞的培养是合适的：但对于一些器官培养， 特别是来自晚期胚胎组织、新生机体组织或某些成体组织的器官，需要在高达95%O₂的气体环境中进行。大部分分散的细胞适合于低氧环境，而有些细胞，如人肿瘤细胞、人胚胎成纤维细胞、间充质干细胞、hESC、角膜缘上皮干细胞及造血干细胞喜欢高氧的环境。

5、渗透压

人血浆的渗透压大约是290mOsm/kg，小鼠的渗透压约为310mOsm/kg。在实际工作中，渗透压为260-320mOsm/kg对大部分细胞都合适。渗透压一般是通过测量培养基冰点的降低值或蒸汽压力的上升值来确定的。如果是自己配制培养基，渗透压的测定是一项很重要的质控步骤，因为它有助于防止配制过程中称量、稀释等方面的错误。如果在培养基的组分中添加某些成分，测定渗透压就更为重要。HEPES和一些药物溶解于强酸、强碱，它们加入培养基后被中和，将会明显地影响培养基的渗透压，通常调节渗透压是通过改变氯化钠的浓度来实现的。

6、温度

确定细胞培养最适温度有不同的依据：①取材动物的体温；②取材组织通常所处的温度（如皮肤和睾丸组织的温度可能要低于身体其他组织的温度）；③温箱调节温度可能出现的微小差异应在细胞可承受的安全范围之内。因此对于大部分人体细胞和温血动物细胞系，推荐的温度是37℃，它接近于体温；

培养中的哺乳动物细胞对低温的耐受范围比较大，能够在4℃存活几天，也能够冻存于-196℃。但它们不能够耐受比正常温度高出2℃的高温（39.5℃），在此温度下它们只能存活几个小时；如果处于40℃及40℃以上的温度，它们将很快死亡。

在细胞培养过程中要注意温度的变化，温箱的门不要长时间地敞开，温箱或温室内整个空间的温度应该是一致的，空气要能够自由地循环。为了让培养瓶内的气相达到37℃，培养瓶在放入温箱或温室后必须旋松瓶盖30min～1h使气体排出，尤其是在重叠堆放时，或使用透气的盖子。

温度除了直接影响细胞的生长，还会影响培养基的pH，因为温度较低时CO₂的溶解性增加，可能还会导致离子强度和缓冲液表观解离常数（pKa）的改变。在室温的条件下，pH应当比在37℃时下调0.2单位。第一次配制某种培养基时，为了检验pH，最好配制成完全培养基，而后取一些样品放在37℃，以合适的气体压力孵育过夜。

7、黏度

培养基的黏度主要受血清含量的影响，大部分情况下对细胞生长的影响很小。但是当细胞悬液被搅动的时候（如搅拌进行悬浮培养），或细胞被胰酶解离之后，培养基的黏度就显得很重要。这时候如果增加培养基的黏度可以使细胞的损伤降低，要增加黏度可以在培养基中加入羧甲基纤维素（CMC）或聚乙烯（PVP）。在低血清、无血清培养及搅拌的生物反应器培养时这点尤其重要。

8、表面张力和成泡性

泡沫的形成通常会使蛋白质的变性率增加，当泡沫到达培养瓶颈部时，也会增加污染的风险。如果泡沫溢出或泡沫位于培养瓶的盖与瓶口之间，或位于培养皿的盖与底座之间，还将限制气体的扩散，影响溶液的pH值。

在搅拌瓶或生物反应器中进行悬浮培养时，若将含有5％CO₂的气体通入含有血清的培养基中通常会增加泡沫的形成。加入一种硅酮树脂抗泡沫剂或0.01％～0.1％的聚醚F68，通过降低表面张力可消除泡沫，也可抵抗来自泡沫的剪切力。