细胞培养相关操作流程

细胞培养相关操作流程

• 完全培养基的配制

安徽浙卫康医疗科技有限公司提供高品质、效果好、稳定性一致的基础细胞培养基，但基础培养基仅可以维持细胞的基本养分，无法促进细胞繁殖和分化，所以还需要为培养基加入血清，后者含有多种细胞因子，可以促进细胞生长。常见的血清有牛血清，马血清和人血清。因此浙卫康基础培养基需要搭配血清进行细胞培养，具体使用哪种血清需视细胞种类来选择。

具体操作步骤如下：

1、开始配制之前，先使用75%乙醇清洁超净工作台面和一些器具，然后把必要的耗材一起放进超净工作台/生物安全柜内紫外照射40min左右。

2、灭菌结束后，打开电源和风机，把玻璃挡板抬高15至20 cm进行操作。

3、配置完全培养基时按照10%-20%的比例向基础培养基内加入血清。（由于不同批次之间的血清对细胞生长的刺激作用会有较大差异，因此如果该批次血清验证效果良好的话，就应大批量购入同一批次。）

4、最后，为了降低微生物污染的风险，可以向培养基添加合适的双抗。请注意，双抗只能对微生物生长起一定的抑制作用，它无法彻底杀灭微生物。防止污染的关键还是无菌操作，配置完成后将完全培养基密封好，并于4℃短期储存或现配现用。

• 贴壁细胞传代

1、从培养容器中吸出并丢弃原先的细胞培养基。

2、使用不含钙和镁的平衡盐溶液洗涤细胞（每10 cm²培养表面积约2 mL）。例浙卫康缓冲液平衡盐系列溶液。

向培养容器附着细胞层的对侧缓慢添加平衡盐溶液，以避免干扰细胞层，并来回摇动数次培养容器。注意：洗涤步骤的作用是去除抑制试剂解离作用的血清、钙和镁等。

3、将平衡盐溶液从培养容器中取出并丢弃。

4、按每25cm²/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入浙卫康消化液，放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入2ml细胞完全培养基以立即终止消化。轻轻摇动容器以完全覆盖细胞层。

5、将培养容器在室温下孵育约2分钟或37℃培养箱1分钟。请注意，实际孵育时间随所用细胞系而异。

6、在显微镜下观察细胞是否解离。如果细胞脱离不到90%，则继续孵育几分钟，每30秒检查解离状况。也可以轻轻摇晃培养容器以加速细胞解离。

7、当≥ 90%的细胞已解离时，添加相当于2倍体积（解离试剂体积的两倍）的预热完全细胞培养基。缓慢冲洗细胞层表面，使细胞悬浮于培养基中。

8、将细胞悬浮液转移到离心管中，并以1200rpm/min离心3-5分钟。请注意，离心速度和时间因细胞类型而异。

9、弃上清，添加适当培养基重悬细胞，取出进行计数。

10、使用细胞计数仪，测定细胞总数和活细胞百分比。如有必要，向细胞中添加生长培养基以达到所需的细胞浓度，并重新计数细胞。

11、将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度，并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中，然后将细胞放回培养箱。

• 悬浮细胞传代

3.1 直接传代法：

1、弃去原培养基中1/2~2/3细胞上清液，添加适当培养基重悬细胞，取出进行计数。

2、使用细胞计数仪，测定细胞总数和活细胞百分比。如有必要，向细胞中添加生长培养基以达到所需的细胞浓度，并重新计数细胞。

3、将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度，并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中，然后将细胞放回培养箱。

3.2 离心传代法

1、用吸头吸取全部细胞悬液至离心管内，1200rpm/min离心3~5min。

2、弃上清，加入适量培养液重悬细胞，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散。取出进行计数。

3、计数方法如3.1所述

• 细胞冻存

1、将冻存管、15毫升离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，紫外线照射30分钟。75%酒精擦拭操作台和双手，准备好冰盒。

2、水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基、浙卫康消化液、浙卫康通用型血清冻存液等，放于水浴箱中预热。

3、从细胞培养箱中取出细胞，进行瓶口消毒，弃去细胞原来的培养基。按每25cm²/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入2ml细胞完全培养基以立即终止消化。

4、采用无菌枪头轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的15毫升离心管内。

5、进行细胞计数。可见每毫升悬液中的活细胞总数。

6、离心后弃上清。将细胞沉淀与冻存液充分混匀，根据计数结果，将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有5×10⁵为宜。

7、将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般一个两毫升冻存管装入1至1.5毫升细胞冻存悬液为宜。

8、在冻存管上注明细胞名称、代数、日期等。

9、严密封口后，进行程序性降温冻存，最后进行液氮保存。

• 细胞解冻与复苏

1、水浴锅预热至37℃备用。

2、准备15mL离心管，加入3mL的完全培养基，比较难养的细胞，可适量增加培养基。

3、将细胞冻存管从液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅。如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中，是为了预防污染。

4、用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化，如果1分钟内没有融化，可能是冻存液量偏多，或者摇晃力度不够。

5、用纸巾擦拭水渍，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管，当同时复苏多管细胞时，注意不要弄混。

6、1200rpm离心3分钟。离心是为了去除DMSO，对于DMSO敏感的细胞，必须离心。

7、弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，放入培养箱。接种至新的无菌培养器皿中复苏的细胞需要一段时间恢复状态，当复苏后的细胞密度低于80%时，48小时内不要换液，待细胞形态、生长速度等恢复正常，再进行细胞传代等操作。（不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃，应耐心等待至少一周。）当然，细胞复苏后状态很好的情况下，可以提前开始后续的细胞培养实验。