免疫细胞培养技术的介绍

免疫细胞（immune cells）是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。

1. 简介

免疫细胞按照来源，可分为髓系和淋巴两类。
髓系免疫细胞（Myeloid immune cells）起源于骨髓，并包括多种类型的细胞，如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸粒细胞等。这些细胞在免疫系统中具有重要的功能，包括吞噬病原体、产生炎症反应和抗原呈递等。
淋巴细胞（Lymphoid immune cells）起源于骨髓，并在淋巴组织（如脾脏、淋巴结和扁桃体）中发挥重要的免疫功能。它们包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等。

1. 培养方法

2.1样本采集与预处理
外周血来源的PBMC是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。具体为外周血采集后，装入含有适宜抗凝剂的无菌容器中防止凝集，其中要求外周血与抗凝剂轻柔混匀。目前，常用的抗凝剂有肝素、EDTA和枸橼酸钠等。适合于后期免疫细胞培养的抗凝剂常用是肝素。
2.2样本制备

1. 单个核细胞（PBMC）的获取：制备方法为常用Ficoll密度梯度离心法。具体方法如下：

①将10ml外周血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
②取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
③900g，离心30min，升1降1。
④离心完成后，依次从上而下，分别收集血浆（微黄色层）、单个核细胞（白膜层）。
⑤单个核细胞（白膜层）加入1-2倍的PBS，400g，离心10min后去掉上清，再加入1640培养基进行相同操作的清洗。
2.3细胞培养
加入完全培养液1ml重悬细胞，混匀计数，按照计数结果调整细胞密度为3-10x10⁵细胞/ml进行铺板培养。详细完全培养添加主要组分如下：

（1）CD8+细胞培养从人外周血单个核细胞中用IL-2、CD3/CD28激活剂体外激活和扩增CD8+细胞。
IL-2对CD8/CTL的扩增、存活和功能至关重要【1-2】。
离体产生记忆干T细胞的方法依赖于CD3 / CD28共刺激以及使用诸如IL-7和IL-15之类的细胞因子【3】。

从人外周血单个核细胞中用IL-2、IL-15、 IL-12 、IL-18等体外激活和扩增NK细胞【4】。
NK细胞的杀伤活性，需要在细胞培养基中添加一些刺激剂，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促进NK细胞的增殖和分化，同时提高细胞的杀伤活性。促进NK细胞的生长和扩增。在一些研究中，还会添加一些其他的细胞因子，如白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-18（IL-18）等，以提高NK细胞的细胞毒性和杀伤作用。

从人外周血单个核细胞中用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC细胞。
GM-CSF，IL-4和TNF-α培养系统中人单核细胞衍生树突状细胞（单DC）的粘附和非粘附细胞的纯度，表型，抗原摄取能力和T淋巴细胞刺激能力。结果表明，粘附DC的纯度和抗原摄取能力均显着高于非粘附DC【5】。

从人外周血单个核细胞中用GM-CSF、M-CSF体外诱导扩增巨噬细胞。
M1和M2巨噬细胞可以被人重组GM-CSF和M-CSF诱导【6】。

免疫细胞不仅可以消灭癌细胞，还可消灭传染病和自身免疫疾病【7】。

【1】Kalia V, Sarkar S. Regulation of Effector and Memory CD8 T Cell Differentiation by IL-2-A Balancing Act. Front Immunol. 2018 Dec 20;9:2987. doi: 10.3389/fimmu.2018.02987. PMID: 30619342; PMCID: PMC6306427.
【2】Noto A, Ngauv P, Trautmann L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. 2013 Dec 17;(82):e51105. doi: 10.3791/51105. PMID: 24378436; PMCID: PMC4111270.
【3】Alvarez-Fernández C, Escribà-Garcia L, Vidal S, Sierra J, Briones J. A short CD3/CD28 costimulation combined with IL-21 enhance the generation of human memory stem T cells for adoptive immunotherapy. J Transl Med. 2016 Jul 19;14(1):214. doi: 10.1186/s12967-016-0973-y. PMID: 27435312; PMCID: PMC4952071.
【4】Lauwerys BR, Garot N, Renauld JC, Houssiau FA. Cytokine production and killer activity of NK/T-NK cells derived with IL-2, IL-15, or the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2000 Aug 15;165(4):1847-53. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847. PMID: 10925263.
【5】Yi HJ, Lu GX. Adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in GM-CSF, IL-4 and TNF-α culture system. Cell Immunol. 2012 May-Jun;277(1-2):44-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2012.05.014. Epub 2012 Jun 7. PMID: 22763269.
【6】Yamane K, Leung KP. Rabbit M1 and M2 macrophages can be induced by human recombinant GM-CSF and M-CSF. FEBS Open Bio. 2016 Aug 15;6(9):945-53. doi: 10.1002/2211-5463.12101. PMID: 27642558; PMCID: PMC5011493.
【7】Weber EW, Maus MV, Mackall CL. The Emerging Landscape of Immune Cell Therapies. Cell. 2020 Apr 2;181(1):46-62. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.001. PMID: 32243795; PMCID: PMC8900215.