naica®微滴芯片数字PCR准确检测精细胞中tRFs差异表达

导读

除了在蛋白质翻译中的作用外，tRNA可以被切割成较短的生物活性片段，称为tRNA片段（tRFs）。来自精细胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代谢紊乱。因此，种系细胞中的tRFs是表观遗传的一种机制，然而压力和毒素会导致tRFs模式的改变。华盛顿大学妇产科临床研究部的研究人员在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上发表题为《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究对注射阿片类药物（一个重要的压力源）是否会影响生殖细胞中的tRFs感兴趣。研究者对来自注射阿片类药物病人(PWID)和非药物使用对照组精液来源外泌体及精母细胞进行了RNA测序。测序后采用naica^®微滴芯片数字PCR技术验证数据，该技术的应用为药物滥用相关生育问题的研究提供了新的策略和方法。

阿片类药物滥用对生殖系统的影响一直备受关注。近期一项研究揭示了注射阿片类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体的变化。该研究通过数字PCR技术检测tRNA-Gly-GCC外泌体，发现未注射阿片类药物的男性与注射阿片类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体存在显著差异。

tRNA-Gly-GCC外泌体在精子发生和成熟过程中扮演关键角色。研究结果表明，这些差异可能与精子质量和生育能力的下降有关。naica^®微滴芯片数字PCR技术在本研究中的应用，不仅提供了高灵敏度和高准确性的检测方法，对揭示阿片类药物对生殖系统的影响具有重要意义。

应用亮点：

▶  naica^®微滴芯片数字PCR技术可以在RNA浓度低于检测下限的样品中检测两种tRFs形式。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR结果与RNA测序结果具有很好的相关性，但比测序具有更高的灵敏度和准确性，有助于深入了解长期使用阿片类药物的生物学影响。

研究结果：

▲图１.男性长期使用阿片类药物导致精子中tRF-Gly亚型比例的变化,使用naica^®微滴芯片数字PCR技术定量tRFs。成熟精子细胞通过45-90% Percoll梯度纯化，并使用核苷素试剂盒分离小RNA。cDNA使用一种特定的茎环RT引物与“长”tsRNA亚型（53个核苷酸长）或另一种靶向“短”tsRNA变体（32个核苷酸长）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“长”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（C）“长”与“短”tRF Gly-GCC亚型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的浓度。“C”：对照组（不注射药品的男性）;“PWID”：阿片药物注射组。P值通过单尾曼-惠特尼U检验计算。对照组：n=10，PWID组：n=13。

研究发现，对照组中超过90%的reads到较短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的读数。相比之下，对照组中只有4.1%的reads到更长的tRF，而PWID为45.6%。PWID的长/短tRF比显著高于对照组。同时发现精液来源的外泌体中小核仁RNA（snoRNA）表达差异。尽管无法确立PWID的发现与阿片类药物使用之间的直接联系，但研究表明阿片类药物注射和/或相关多药使用习惯和生活方式改变可能会影响表观遗传。这为阿片类药物使用的可遗传影响提供了证据，并为进一步研究其跨代健康影响的机制奠定了基础。

数字PCR技术在研究PWID中差异表达的tRFs方面发挥了重要作用。由于精液中含有复杂的细胞混合物，意味着其中含有抑制剂，对于PCR的扩增有很大影响。但数字PCR有抗抑制剂干扰的特点，所以对于这类复杂样本的检测更为适用。文章中数字PCR和测序各自发挥了作用：测序用于发现长tRF和短tRF，而数字PCR则准确检测了tRF片段的表达差异，进而验证了测序的结果。这一发现表明，数字PCR在研究tRFs和其他非编码RNA片段方面具有显著的优势。数字PCR不仅可以在tRFs和其他类似的研究中提供更为精确的结果，还可以在诸如癌症、遗传学和传染病等领域发挥关键作用。

naica^®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。