Echo Revolve显微镜在结核病的治疗途径与药物学研究中的应用

前言

结核病（TB）仍然是单一传染源的首要死亡原因。2017年，估计出现了超过55万例耐多药/利福平结核病（MDR/RR-TB）新病例，强调需要新的治疗策略。利奈唑胺（LZD）是一种治疗耐药革兰氏阳性感染的有效抗生素，也是结核病的有效治疗方法。然而，长期使用LZD可导致LZD相关的宿主毒性，最常见的是骨髓抑制。LZD毒性可能由IL-1介导，IL-1是结核分枝杆菌感染期间早期免疫的重要炎症途径。然而，IL-1可导致结核病进展后期的病理学和疾病严重性。

由于IL-1可能有助于LZD毒性，并确实影响结核病病理学，因此本实验将这一途径作为潜在的宿主导向治疗（HDT）的靶点。本实验假设LZD的疗效可以通过调节IL-1途径来增强，以减少骨髓毒性和结核相关炎症。

本文使用两种结核病动物模型进行研究，一种是结核病易感小鼠模型和临床相关猕猴。在本研究中应用Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜首先对小鼠肺组织的病变情况进行观察，以及肺组织病变面积的测量及可视化呈现；其次观察猕猴胸骨骨髓组织切片，比较细胞数量和差异性变化。荧光显微镜观察鼠抗CD3e、鼠抗Ly-6G抗体在肺组织中的特异性表达情况。

通过苏木精-伊红（HE）染色对WT或Nos2-/-小鼠的单个肺叶进行组织病理学分析。αIL-1R1治疗降低了肺脏的平均细菌负荷（图1）。αIL-1R1治疗没有加重任何一种小鼠株的疾病。

▲ 图1 苏木精-伊红（HE）染色对WT或Nos2-/-小鼠单个肺叶的组织病理学分析结果

作者使用鼠抗CD3e、鼠抗Ly-6G抗体孵育，在Echo Revolve 4荧光显微镜DAPI FITC和RFP3个通道下分别观察继发性荧光和自发性荧光，将3个通道的图像叠加，可观察到图像中的紫色为抗体在肺组织中特异性表达，见图2。

由于对Mtb感染和LZD治疗产生的IL-1β在很大程度上取决于NLRP3炎症体，本文还研究了一种方案，其中在感染后56天和77天之间施用LZD和小分子NLRP3抑制剂（MCC950）。如αIL-1R1所观察到的，与LZD单独相比，添加MCC950减少了肺中的PMN数量，并且没有显著改变细菌杀灭（图2）。

▲ 图2 不同治疗组的肺部组织免疫荧光图像

用DAPI染色的细胞核（蓝色）、用鼠抗CD3ε染色的T细胞（绿色）和用鼠抗Ly-6G染色的中性粒细胞（红色）

为了证实我们的观察结果，病理学家评估了猕猴骨髓组织切片。结果发现不同治疗组，如TB组、LZD组和LZD+IL-1Rn组在细胞数量（髓系：红系比率）或异常方面没有明显差异（图3）。

▲图3 猕猴尸检时获得的胸骨骨髓的代表性HE图像

图片中的左侧图像为20X拍摄结果，右侧图像为40X拍摄结果

研究亮点：

▶  本文使用Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜眀场清晰观察到小鼠肺组织的病灶情况，还清晰观察到猕猴胸骨骨髓细胞分布状况以及进行不同治疗组间细胞数量比较；眀场可一键快速切换到荧光成像，荧光观察对不同治疗组的肺部组织中的抗体特异性表达进行清晰观察。

▶  阐明了小鼠和猕猴之间骨髓抑制的差异突出了在人类实验之前评估多个模型中HDT的重要性；在两种模型中，IL-1Rn给药对宿主的影响，以及对Mtb和LZD功效的反应，可以通过显微镜观察两种模型细胞中的病灶变化，细胞数量以及差异性变化来鉴定IL-1与LZD联合抑制是否对结核病治疗有效。本文研究数据为IL-1Rn作为结核病的潜在治疗提供了临床前数据。

原文：doi: 10.3389/fimmu.2020.00891

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