如何高效提取原代细胞？
本文结合具体实验数据讲述机械破碎+酶消化方法结合高效提取组织内活细胞的方法。
原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。
那么，如何快速、高效地提取原代细胞呢？小编分享以下两种方法供大家参考。
1
组织处理器+解离试剂盒
传统机械法对细胞损伤极大；单纯酶解法则无法保证高效率、高活性地提取单细胞。组织处理器结合组织解离试剂盒则能在结合二者的优势的基础上避免各自存在的缺陷，温和、高效地提取单细胞。
（1）实验所需试剂及器材：组织解离试剂盒，RPMI-1640高糖培养基，DMEM培养基，红细胞裂解液（根据实验需要选用），PBS，一次性无菌过滤器（70 μm），恒温摇床，组织破碎细胞分离器，C管，低速离心机，0.22 μm无菌过滤器。
（2）小鼠组织：小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾组织。
（1）解剖小鼠，取出各组织器官，75%乙醇清洗后，PBS进行漂洗，分别放入离心管备用。
（2）配制Enzyme A溶液（根据实验需要选用），同理配制Enzyme B, Enzyme C, Enzyme D溶液（将配制好的酶溶液分装，保存于-20℃，避免反复冻融。该溶液可在-20℃稳定保存6个月）。
（3）向C管中加入RPMI-1640高糖培养基或DMEM培养基（根据实验需要选用）、Enzyme A、Enzyme B、Enzyme C、Enzyme D，混匀，配制成混合酶消化液。
（4）将组织置于5mL离心管中并剪成1-4 mm大小的小块，加入适量PBS，移液枪轻微吹打后400×g离心5分钟，用移液枪慢慢吸取上清液（肺组织为下清夜）废弃。
（5）将离心后的组织块放入装有混合酶消化液的C管中。
（6）拧紧C管，倒置，安装到组织破碎细胞分离器的套管中。
（7） 运行组织破碎细胞分离器程序。
（8）程序结束后，从组织破碎细胞分离器上取下C管。
（9）将C管安装到恒温摇床上，作用时间根据实验需要进行设置。
（恒温摇床条件：转速200rpm、37℃；恒温摇床每作用30min，重复步骤（6）（7）（8）一次）
（10）将C管内的组织匀浆用一次性无菌过滤器（70 μm）过滤，50 mL离心管收集滤液。
（11）适量RPMI-1640或DMEM冲洗一次性无菌过滤器（70 μm），一并用50 mL离心管收集滤液。
（12）将细胞悬液400×g离心7分钟，弃上清。
（13）用1-3mL PBS重悬细胞，400×g离心7分钟，弃上清。
（14）重复步骤15，直至离心后上清液澄清。
（15）利用RPMI-1640或DMEM重悬细胞，用于下游实验。
（1）RPMI-1640或DMEM含10%血清和1%双抗（100u/mL的青霉素，100u/mL的链霉素）。
（2）混合酶消化液应在使用前彻底混匀。
（3）如果在组织解离后进行细胞培养，则应在混合酶消化液使用前对混合酶消化液进行无菌过滤。每处理0.01-2g组织大约需要5 mL混合酶消化液。
（4）尽量剪去组织样本的脂肪、纤维和坏死组织。
2
组织解离试剂盒
然而并非每间实验室都备有组织处理器，那么单纯使用组织解离试剂盒的解离效果如何呢？我们也做了相关的实验，下面具体来看看吧！
（1）实验所需试剂及器材：组织解离试剂盒，RPMI-1640高糖培养基，DMEM培养基，PBS，一次性无菌过滤器（70 μm），恒温摇床，低速离心机，0.22 μm无菌过滤器。
（2）小鼠组织：小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾组织。
（1）解剖小鼠，取出各组织器官，75%乙醇清洗后，PBS进行漂洗，分别放入离心管备用。
注意：解剖过程中，需经常用75%乙醇对器械进行清洗消毒，避免对样本造成污染。
（2）根据组织解离试剂盒说明书，配制Enzyme A溶液（根据实验需要选用），同理配制Enzyme B, Enzyme C, Enzyme D溶液（将配制好的溶液分装，保存于-20℃，避免反复冻融。该溶液可在-20℃稳定保存6个月）。
|
名称 |
规格 |
数量 |
|
Enzyme A（冻干粉） |
20mg |
1瓶 |
|
Enzyme B（冻干粉） |
10mg |
1瓶 |
|
Enzyme C（冻干粉） |
60mg |
1瓶 |
|
Enzyme D（冻干粉） |
120mg |
1瓶 |
|
Buffer |
25mL |
1瓶 |
（2）向C管中加入RPMI-1640高糖培养基或DMEM培养基（根据实验需要选用）、Enzyme A、Enzyme B、Enzyme C、Enzyme D，混匀，配制成混合消化液。
（3）将组织置于5mL离心管中并剪成1-4 mm大小的小块，加入适量PBS，移液枪轻微吹打后400×g离心5分钟，用移液枪慢慢吸取上清液（肺组织为下清夜）废弃。
（4）将离心后的组织块放入装有混合酶消化液的离心管中。
（5）将离心管安装到恒温摇床上，作用时间根据实验需要进行设置。
（6）将离心管内的组织匀浆用一次性无菌过滤器（70 μm）过滤，50 mL离心管收集滤液。
（7）适量RPMI-1640或DMEM冲洗一次性无菌过滤器（70 μm），一并用50 mL离心管收集滤液。
（8）将细胞悬液400×g离心7分钟，弃上清。
（9）用1-3mL PBS重悬细胞，400×g离心7分钟，弃上清。
（10）重复步骤9，直至离心后上清液澄清。
（11）利用RPMI-1640或DMEM重悬细胞，用于下游实验。
（1）RPMI-1640或DMEM含10%血清和1%双抗（100u/mL的青霉素，100u/mL的链霉素）。
（2）混合酶消化液应在使用前彻底混匀。
（3）如果在组织解离后进行细胞培养，则应在混合酶消化液使用前对混合酶消化液进行无菌过滤。每处理0.01-2g组织大约需要5 mL混合酶消化液。
（4）尽量剪去组织样本的脂肪、纤维和坏死组织。
根据细胞计数器得到的数据，组织处理器结合组织解离试剂盒从0.08g肺组织里提取的单细胞数量为5.12*10的6次方，单独使用组织解离试剂盒从0.08g肺组织里提取的单细胞数量为4.6*10的6次方，后续细胞培养活性略差。
因此，如果对细胞数量、活性要求较高，且条件允许，采用组织处理器结合组织解离试剂盒方法提取细胞，效果会更好。因为组织处理器不仅能温和、高效地提取细胞，操作过程也能有效避免细胞污染；对于原代细胞提取实验不多或者对细胞活性及数量要求不是那么高的，单独使用组织解离试剂盒也能达到相对理想的提取效果。
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