软琼脂细胞克隆试剂盒检验的步骤说明

软琼脂细胞克隆试剂盒特别适用于动物或人体转化型体细胞和转染后细胞的生长。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，操作简便，重复一致。

实验步骤如下：

实验开始前，将4℃冰箱里的试剂盒中的所有试剂溶液放进37℃恒温水浴里预热。然后进行下列操作。

一、 细胞培养瓶（25cm2）操作

1． 将克隆液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出）

2． 放进50℃恒温水浴

3． 移出15毫升预热的高养液（Reagent B）到50毫升锥形离心管

4． 移出15毫升克隆液（Reagent A）到50毫升锥形离心管

5． 轻度涡旋震荡或用手摇动锥形离心管，充分混匀

6． 最快速度分别移入3毫升（每个3毫升）到10个25cm2细胞培养瓶

7． 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生

8． 置于室温下至少2小时，使胶体凝固

9． 准备1瓶25cm2或75cm2细胞培养瓶的待测细胞，清洗，脱落，计数

10． 移出1毫升（总量为2500个细胞）到15毫升锥形离心管

11． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入2.25毫升预热的中养液（Reagent C），用枪头上下轻柔抽吸混匀（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）

14． 加入750微升克隆液（Reagent A），用枪头上下轻柔抽吸混匀

15． 最快速度全部移入到1个25cm2细胞培养瓶里，置于已凝固的胶体上面

16． 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生

17． 置于室温下至少2小时，使胶体凝固

18． 放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育

19． 次日，轻轻加入3毫升低养液（Reagent D）在胶体上面（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）

20． 1周后，再次加入3毫升低养液（Reagent D）在胶体上面

21． 2周后，在倒置显微镜下观察细胞：细胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括细胞集落数目、细胞集落大小，以及贴壁非依赖型生长等

22． （选择步骤）小心抽去低养液（Reagent D）

23． （选择步骤）用细胞刮脱棒小心刮落含有细胞集落的中养层

24． （选择步骤）用1000微升枪头（翦去顶端部分）吸出细胞集落

25． （选择步骤）加入到25cm2细胞培养瓶

26． （选择步骤）加入3毫升用户自备的完全细胞培养液

27． （选择步骤）用5毫升移液管抽吸，充分打碎细胞集落

28． （选择步骤）放进37℃二氧化碳细胞培养箱继续孵育

二、细胞培养板（12孔板）操作

1． 将克隆液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出）

2． 放进50℃恒温水浴

3． 移出10毫升预热的高养液（Reagent B）到50毫升锥形离心管

4． 移出10毫升克隆液（Reagent A）到50毫升锥形离心管

5． 轻度涡旋震荡或用手摇动锥形离心管，充分混匀

6． 最快速度分别移入1.5毫升（每孔1.5毫升）到12孔细胞培养板的每个孔里

7． 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生

8． 置于室温下至少2小时，使胶体凝固

9． 准备1瓶25cm2或75cm2细胞培养瓶的待测细胞，清洗，脱落，计数

10． 移出1毫升（总量为2500个细胞）到15毫升锥形离心管

11． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入1.125毫升预热的中养液（Reagent C），用枪头上下轻柔抽吸混匀（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）

14． 加入375微升克隆液（Reagent A），用枪头上下轻柔抽吸混匀

15． 最快速度全部移入到12孔细胞培养板的1个孔里，置于已凝固的胶体上面

16． 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生

17． 置于室温下至少2小时，使胶体凝固

18． 放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育

19． 次日，轻轻加入500微升低养液（Reagent D）在胶体上面（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）

20． 1周后，再次加入500微升低养液（Reagent D）在胶体上面

21． 2周后，在倒置显微镜下观察细胞：细胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括细胞集落数目、细胞集落大小，以及贴壁非依赖型生长等

22． （选择步骤）小心抽去低养液（Reagent D）

23． （选择步骤）用细胞刮脱棒小心刮落含有细胞集落的中养层

24． （选择步骤）用1000微升枪头（翦去顶端部分）吸出细胞集落

25． （选择步骤）加入到25cm2细胞培养瓶或6孔细胞培养板的1个孔里

26． （选择步骤）加入3毫升用户自备的完全细胞培养液

27． （选择步骤）用5毫升移液管抽吸，充分打碎细胞集落

28． （选择步骤）放进37℃二氧化碳细胞培养箱继续孵育