6xHis 标签蛋白镍柱纯化方法 Protocol

　1、 溶液准备：

　　1.1 结合缓冲溶液(Binding Buffer):10mM PB,500mM NaCl,10mM咪唑，PH7.4;

　　1.2 洗脱缓冲溶液1(Elution Buffer1):10mM PB,500mM NaCl,50mM 咪唑，PH7.4;

　　1.3 洗脱缓冲溶液2(Elution Buffer2):10mM PB,500mM NaCl,250mM 咪唑，PH7.4

　　1.4 洗脱缓冲溶液3(Elution Buffer3):10mM PB,500mM NaCl,500mM 咪唑，PH7.4

　　1.5 变性缓冲溶液：10mM PB,500mM NaCl,8M尿素，PH7.4;

　　1.6 CIP溶液：0.5M NaOH,1M NaCl

　　1.7 层析填料：Ni Crystarose FF

　　2、 样品准备：

　　2.1 原核胞内可溶性表达样品：

　　a)细菌经过诱导表达后，用高速冷冻离心机离心(7000rpm,30min),弃上清。

　　b)用Binding Buffer重悬菌体;

　　c)超声波破碎机裂解30分钟;

　　d)10000rpm低温离心15min,取上清;

　　3、 6xHis标签蛋白亲和层析

　　3.1 平衡，用5倍体积的Binding Buffer平衡层析柱;

　　3.2 上样，流速150cm/h;

　　3.3 洗柱，用3---5倍体积的Binding Buffer冲洗层析柱直到和基线平行，流速为300cm/h;

　　3.4 洗杂，用Elution Buffer1冲洗层析柱3-5个体积，此时洗脱下来的都是杂蛋白和核酸等杂质，流速300cm/h

　　3.4 阶段洗脱，用Elution Buffer2和Elution Buffer3分别洗脱，收集洗脱液。

　　4、 CIP

　　4.1 用去离子水冲洗层析柱5---10个体积，流速为600cm/h;

　　4.2 用5倍体积的CIP溶液冲洗层析柱，流速为75cm/h,此时流速不宜太快，防止损坏柱子，

　　4.3 先用去离子水低流速冲洗层析柱5个体积，流速为75cm/h,在用去离子水高流速冲洗层析柱5个体积，流速为600cm/h;

　　4.4 用20%乙醇溶液冲洗层析柱5个体积，流速为300cm/h.

　　4.5 保存。