Nat Genet | 为何很多吸烟者不会患肺癌？单细胞测序发现部分吸烟者肺部体细胞突变频率存在上限
已有研究表明，烟草烟雾中含有至少69种致癌物，例如多环芳烃（PAHs），当人体暴露于这些致癌物中会引起DNA损伤，使体内关键基因发生永久性突变并逐渐积累，最终导致恶性肿瘤发生。众所周知，吸烟有害健康，但吸烟导致肺癌也属于一个概率问题，据报道70%的吸烟相关死亡发生在高龄人群中，80%~90%的终生吸烟者从未患上肺癌，只有少数烟民才会患肺癌。
为什么大多数烟民不会患肺癌？一项新的单细胞分析研究给出了答案。来自纽约阿尔伯特·爱因斯坦医学院的Jan Vijg教授领导的研究团队，通过利用改进的单细胞全基因组测序技术对不吸烟者和吸烟者的肺细胞进行测序，定量分析了随着年龄增长和终生暴露在烟草烟雾中的单个支气管上皮细胞的突变负荷，以剖析这两个关键致癌因素各自的影响。结果显示，随着年龄的增长，突变会在人们的肺部积累；相对于不吸烟者，吸烟者肺细胞中的突变频率更高。此外，当吸烟的剂量累积到一定量时，DNA突变率增加趋于平稳，重度吸烟者的突变频率与轻度吸烟者没有显著差异，这限制了肺部细胞的突变积累，从而降低肺癌风险。研究成果已发表于Nature Genetics期刊上，文章题为“Single-cell analysis of somatic mutations in human bronchial epithelial cells in relation to aging and smoking”。
文章发表于Nature Genetics
在进行单细胞基因组分析之前，研究团队必须首先获得足够的DNA，即进行全基因组扩增（WGA）。但WGA通常在核苷酸序列中产生错误，这可能错误地指示突变的存在。2017年，Jan Vijg教授团队开发并验证了一种能够准确鉴定单细胞基因组中突变的新方法：单细胞多重置换扩增（SCMDA）技术，能够校正可能由基因扩增引起的核苷酸序列错误。研究团队利用SCMDA技术成功对新生儿以及百岁老人的B淋巴细胞全基因组突变进行了分析，发现B细胞中的突变会随着年龄的增长而显著增加，并且突变图谱与B细胞淋巴癌中观察到的特征相似。此外，通过检测肝细胞中随着年龄变化的突变，发现人类肝细胞的突变随着年龄指数累积。
主要研究内容及结论
在这项最新研究中，研究人员基于SCMDA技术对14名年龄在11~86岁不吸烟者和19名44~81岁吸烟者的正常近端支气管基底细胞（PBBC）进行单细胞测序。19名吸烟者中有14人被诊断出肺癌，非吸烟者中有1名患有肺癌。为了表征突变谱，研究人员分析了每个参与者3-8个单细胞核，并观察了这些样本中单核苷酸变异（SNV）和插入缺失（INDEL）的数量变化。
图1. 从人肺中分离、处理和分析PBBC的示意图。来源：Nature Genetics
不吸烟者PBBC中与年龄相关的突变积累
为了研究PBBC中的突变频率与年龄的关系，研究人员对来自不吸烟者的单个PBBC细胞核中的体细胞突变（包括SNV和INDEL）进行了定量分析。发现参与者中每个细胞核的SNV中位数从约464个（11岁儿童）到约2739个（86岁老年人）不等，这意味着每个细胞每年发生28个突变。INDEL的中位数也随着年龄的增长而增加，范围从约59个（11岁儿童）到约304个（86岁老年人）不等，相当于每个细胞每年约有两个INDEL。值得注意的是，来自最年轻参与者PBBC中每个细胞核的SNV中位数与研究团队之前报道的B淋巴细胞或肝细胞中年轻参与者的SNV中位数相同。
图2. 不吸烟者的 SNV 和 INDEL 频率与年龄的关系。b和c图中每个数据点表示来自每个个体的每个细胞核的突变频率。d和e图中每个数据点表示来自每个个体的3-5个细胞核的突变频率的中位数和最小和最大范围。来源：Nature Genetics
吸烟者PBBC的突变频率
分析发现，吸烟者PBBC的突变频率与年龄的关系和不吸烟者相似，吸烟者细胞中的突变频率也随着年龄的增长而增加，虽然速度明显更高，估计为每个细胞每年91个SNV，比不吸烟者多63个SNV（图 3a）。对INDEL分析发现，在所有参与者中都观察到随着年龄的增长而显著增加的趋势。但与同龄不吸烟者相比，44-81岁吸烟者的INDEL频率更高（图3b）。
图3. 吸烟者和非吸烟者中每个细胞核的SNV (a)和INDE (b)的中位数。来源：Nature Genetics
为了更好地了解吸烟和突变负荷之间的关系，研究人员分析了正常PBBC中的突变频率与累积吸烟剂量之间的函数关系（图4c）。在没有异常参与者的情况下，突变频率线性增加至23包/年，（自我报告的包年，定义为每天吸烟20支，持续1年），然后趋于稳定。在包括异常参与者时，突变频率的非线性增加与没有异常参与者的情况基本相同，在23包/年发现了相同的变化点。研究结果表明，重度吸烟者（>60包/年）的PBBC中突变频率不高于中度（20.1–60包/年）吸烟者的突变频率（图4d），这可能是由于某些个体对突变诱导的适应能力增强，体内具有更准确或更稳健的DNA修复或复制机制。
图4. c，所有个体的SNV频率与吸烟包年数的关系（n = 33）；d，基于吸烟包年数的不同人群的SNV频率，方框分别表示从不（n = 14）、轻度（n = 6）、中度（n = 6）和重度（n = 7）吸烟组的中位数和四分位数间距。来源：Nature Genetics
突变特征
此外，研究人员还分析了与衰老或吸烟相关的体细胞突变特征。对吸烟者PBBC中发现的单碱基取代（SBS）特征进行分析，再次证明了SBS4是吸烟者肺部肿瘤的主要特征，不吸烟者几乎不存在SBS4（图5a）。研究发现，虽然吸烟者中归因于SBS4的突变数量显著较高，但与年龄无关（图5b）；SBS5基因的突变与吸烟情况显著相关，且与实际年龄有更强的相关性（图5c）。
图5. a，（左）不吸烟者和吸烟者的单个核的突变光谱和（右）堆叠条形图显示了不吸烟者和吸烟者测量的所有核中突变特征对SNV的比例贡献; b，归因于SBS4特征的SNV中位数与个人年龄的关系; c, 归因于SBS5特征的SNV中位数与个人年龄的关系。来源: Nature Genetics
结 语
研究人员利用一种改进的单细胞测序技术，分析了人类肺细胞的体细胞突变与年龄和吸烟状况的关系。对广泛年龄范围的吸烟者和非吸烟者进行肺部单细胞突变分析证实，随着年龄的增长，人类肺细胞中的突变会累积，但吸烟者PBBC中的突变水平更高，所以吸烟对于人类健康的危害不容忽视。
该研究最有趣的发现是观察到吸烟者的突变频率与吸烟剂量之间的关系，突变频率在23包/年左右保持稳定水平，重度吸烟者的突变负荷与轻度吸烟者没有显著差异。重要的是，该研究结果解答了大多数人的一个疑惑，即为什么大多数吸烟者从未患过肺癌？重度吸烟者体内可能具有某些内在调控机制，例如通过提高DNA修复准确性或通过提高烟草烟雾的解毒能力来减少DNA损伤，但需要强调的是并不是每个吸烟者都具有这种调控能力，能够躲避肺癌的侵袭。
参考资料：
1. Zhenqiu Huang; Shixiang Sun; Moonsook Lee, et al. Single-cell analysis of somatic mutations in human bronchial epithelial cells in relation to aging and smoking. Nature Genetics，2022. DOI: 10.1038/s41588-022-01035-w
2.https://wiki.antpedia.com/danxibaojiyinzutubianjiancexintupo-1391711-news
3.https://www.genomeweb.com/sequencing/single-cell-sequencing-study-finds-increased-single-nucleotide-mutation-rate-lungs
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