Nat. Biotechnol 北大魏文胜团队发表新型高通量基因功能筛选方法-BARBEKO
随着基因组靶向编辑技术的出现, 对单一真核基因进行定点编辑的遗传技术得以迅速发展。CRISPR/Cas9系统因其简便和高效的特性，已被用于进一步开发强大的遗传筛选方法，用于各种生物医学场景中遗传元素的功能注释，包括癌症研究和药物发现。
CRISPR/Cas9系统在表达Cas9蛋白的基础上, 使用人工设计的向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）通过碱基互补配对的方式与靶位点特异结合, 可完成目的区域双链DNA断裂（double-strand breaks ，DSBs）, 实现宿主细胞DNA错误修复或基因敲除的目的，所以经典的CRISPR敲除筛选依赖于Cas9诱导的DNA双链断裂来生成靶向基因敲除。但DNA双链断裂的产生如果修复不及时会造成严重的细胞损伤。因此，Cas9靶向基因组多拷贝位点时极易引起细胞死亡，从而影响基因功能筛选的准确性。已有研究报道称，Cas9诱导的DSBs通过激活p53信号通路，导致细胞生长停滞，对人类原代细胞的高通量筛选构成了障碍。
为保证筛选结果的准确性，需要避免混合型文库中的“搭车效应”。通常的方法要求在慢病毒侵染构建文库时保证较低的感染复数（MOI），同时为获得高度可重复性的结果，进行多组实验重复。这些要求使常规筛选工作量巨大，当细胞来源受限时（如原代细胞），难以实现大规模的功能性筛选研究。
为解决以上难题，北京大学魏文胜课题组在2019年已建立了允许高感染复数构建CRISPR文库的新方法。重新设计的sgRNA被赋予多条分子条形码，被命名为iBAR。使用内含条形码（iBARs）的sgRNA，可以在高MOI条件下进行高通量CRISPR筛选（CRISPR iBAR），显著降低了工作量，提高了筛选准确性，为在原代细胞或动物体内筛选提供了重要工具。虽然CRISPR iBAR在正向选择筛选方面优于传统方法，但Cas9诱导的DSBs的细胞毒性仍限制了其在更广泛场景中的应用，如负性选择筛选。
近日，北京大学魏文胜课题组在Nature Biotechnology期刊上发表了题为 “Genome-wide interrogation of gene functions through base editor screens empowered by barcoded sgRNAs”的文章。结合课题组之前建立的内置分子条形码（iBAR）设计sgRNA，研究团队建立了一种名为iBARed cytosine Base Editing-mediated gene KnockOut （BARBEKO）的新型筛选方案。该方法利用胞嘧啶单碱基编辑器（cytosine base editors ，CBEs），通过破坏基因起始密码子位点或剪接位点、或通过引入提前终止密码子的方式来实现基因组规模的敲除筛选。BARBEKO方法显著降低了试验所需的细胞数量，且无需依赖DNA的双链断裂，能够通用于正向和负向选择筛选。
文章发表于Nature Biotechnology期刊上
主要研究内容
BARBEKO是一种有效的基因敲除策略
研究人员建立了一个全基因组BARBEKO筛选策略，其中CBEs通过破坏剪接位点、起始位点或引入提前终止密码子来实现基因敲除。为评估CBEs产生基因敲除的性能，研究人员在炭疽毒素受体基因ANTXR1和白喉毒素受体基因HBEGF10的基因组位点上设计了多个SgRNAs，并将这些SgRNAs分别转导到CBE表达的HeLa细胞中。通过检测AncBE4max（最有效的CBEs之一）的编辑动力学，证明基于CBE的BARBEKO方法可实现高效基因敲除。此外，研究人员进一步检测了AncBE4max在负向选择筛选中的有效性，比较了AncBE4max与Cas9基因敲除的筛选效率。通过靶向两个核心关键基因（RPL11和RPL23A），发现Cas9和AncBE4max介导的基因敲除都有效地抑制了K562细胞增殖。测序分析表明，CBE在基因敲除方面与Cas9水平相当。因此，AncBE4max能够胜任正向和负向选择筛选。
图1.基于CBE的基因组规模sgRNA文库的设计。来源：Nature Biotechnology
BARBEKO实现在高MoI下进行细胞适应性筛选
研究人员将BARBEKO方法应用于HeLa细胞中，创新性开发了一种名为ZFC iBAR的分析算法，进一步提高了筛选的信噪比和精确度。与CRISPR iBAR和常规Cas9筛选相比，BARBEKO在0.331的MOI下进行的细胞适应筛选表现出显著优势，揭示了必需基因最大程度的缺失，并且通过箱形图更好地分离了必需和非必需基因的分布。以上结果表明，BARBEKO能够有效进行基因敲除筛选，同时控制假阳性率的发生。此外，将BARBEKO方法成功应用于K562和RPE1细胞，发现所有细胞系均可在高MoI下进行适应性筛选。表明BARBEKO方法是一种稳健的策略，即使在极高MoI的慢病毒感染构建的细胞库上也能产生高度一致的结果，大大提高了正向和负向选择筛选的效率。
图2.HeLa细胞中适应性筛选的工作流程（a）和ZFCiBAR 算法的示意图（b）。来源：Nature Biotechnology
BARBEKO有效避免基因拷贝数效应
已有研究表明，Cas9介导可在基因必要筛选中引入基因拷贝数效应。为了验证BARBEKO是否可以避免这样的问题，研究人员比较了在HeLa细胞中，BARBEKO 和 CRISPR iBAR 筛选的基因拷贝数的sgRNA zLFC分布。研究发现，sgRNA的zLFC在靶向基因组位点的下降与CRISPR iBAR筛选中拷贝数的增加相关，这是DSB诱导的细胞毒性的结果。相比之下，BARBEKO不受拷贝数扩增的影响。为了证实这一点，研究人员选择了位于HeLa细胞扩增基因组区域的两个基因（SDHA和TRIP13），在AncBE4max和Cas9表达细胞中分别检测了四种SDHA靶向的sgRNAs。结果显示，在AncBE4max表达细胞中没有观察到明显的变化，在Cas9表达细胞中观察到细胞活力显著降低。经研究证明，Cas9表达细胞中细胞活力的降低不是由于基因敲除导致而是由于多个DSB的出现，TRIP13基因靶向编辑也获得了相似的结果。因此，BARBEKO这种功能缺失的筛选策略，不受拷贝数效应和编辑工具诱导的细胞毒性的影响。
图3.BARBEKO方法会减弱拷贝数效应影响。来源：Nature Biotechnology
小结
该研究开发了一种名为BARBEKO的新方法，该方法结合了胞嘧啶单碱基编辑器和内置分子条形码（iBAR）的sgRNA，成功用于高通量基因筛选。BARBEKO与传统的CRISPR敲除筛选方法相比，有三大优点：一、相同的覆盖水平，BARBEKO方法可显著减少建库所需的细胞数量；二、以iBARs作为内部复制物，提高了筛选质量；三、有效避免基因拷贝数效应，无需依赖DNA的双链断裂，不受细胞毒性的影响。这些使得 BARBEKO在筛选DSB敏感细胞类型以及筛选细胞适应性方面有着广阔的应用前景。
参考文献：
1. Zhu, S., Cao, Z., Liu, Z. et al. Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens. Genome Biol 20, 20 (2019). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1628-0
2. Yudovich, D., Bäckström, A., Schmiderer, L. et al. Combined lentiviral- and RNA-mediated CRISPR/Cas9 delivery for efficient and traceable gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep 10, 22393 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-79724-x
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