干货 | 杂交捕获时封闭试剂的作用原理，你真的了解吗？

在液相探针杂交捕获技术的诞生之初，并不是加入两种封阻试剂，而是只加入一种，Cot-1。开发者认为足够长的探针可以保证探针-文库之间结合的牢固程度，使得可以通过后续的剧烈洗脱步骤来最大程度减少由于探针的cross-hybridization以及不同文库分子间产生的adapter结合所导致的非特异性捕获（The length of the baits allows thorough washes at high stringency to minimize contamination with nontargeted sequences that would cross-hybridize to the bait or hybridize to legitimate target fragments via the common adaptor sequence.）[1]。但是Cot-1必须添加，来减少高拷贝/重复序列对探针捕获时特异性的影响（A related source of background, indirect pull-down of repetitive passenger DNA fragments, is suppressed by addition of Cot-1 DNA to block repeats during the hybridization.）[1]。这说明在提高杂交的特异性方面，Cot-1的作用非常明显，必须使用。

Cot-1，指的是Cot值为1时，经高温变性后又复性为双链的DNA。Cot本身是描述DNA动力学特点的参数。其公式为Cot=ct，其中c是物质的量浓度，单位是mol/L；t是时间，单位是s[2]。当Cot的值为1时，通过计算c和t的数值，就可以通过调整实验参数来获得双链的Cot-1 DNA了。由于DNA复性时的热动力学特性是序列复杂度低的片段最先复性，所以Cot-1所包含的DNA序列基本都是重复性序列，如LINE、SINE等。当参数继续调整时，还可以获得Cot-2，或者Cot-10[3]。

Cot-1最早是在核酸杂交实验中，用来避免探针的非特异性结合所导致的背景噪音的[4]。由于早期的核酸杂交探针都是天然的DNA，难免包含重复性序列，所以在杂交时，探针除了和目标区域结合外，还会因为探针中含有的重复序列而导致探针非特异性地结合到基因组的其他位置（即cross-hybridization），产生干扰性的信号。Cot-1可以和基因组中的重复序列结合，从而阻止探针和这些区域的结合，提高探针杂交的信噪比。因此，在aCGH、FISH等实验中，都需要使用Cot-1 DNA。

具体到液相探针杂交捕获的实验中，虽然探针是人工设计的序列，可以最大程度避免探针和高拷贝/重复性序列结合，但考虑到探针与文库结合时，只需要产生一定数量的氢键就可以保持稳定抓取[5]，所以为了提高捕获的特异性，仍然需要加入Cot-1 DNA，来避免探针和重复性序列的文库之间产生cross-hybridization。

图2.Cot-1不足时探针非特异结合示意图

如图2所示， Cot-1不足时，探针会非特异地结合到重复序列上，即使这种结合并不非常充分，或者只有部分区域的结果。但这种结合会导致捕获特异性显著下降。

有观点认为Cot-1是避免文库与文库之间的重复性序列产生结合，即探针抓取的靶标文库上结合有非靶标文库，导致捕获的特异性下降。考虑到Cot-1 DNA普遍长度为上百bp，而探针的长度也有100-120nt，靶向捕获的DNA文库，插入片段通常在150-200bp之间，探针的结合会导致文库之间没有充分的结合空间，所以我们认为这种作用是较为次要的。

Universal Blocker的作用相对明确，就是阻止不同文库分子通过adapter之间的互补序列产生结合。

图4.接头封阻试剂不足时的影响。非靶标文库通过接头序列的互补从而结合。示意图未考虑序列方向。

迪赢生物为illunima和MGI平台靶向捕获流程设计了接头封阻试剂，并提供单独的人Cot-1 DNA，支持多样本杂交，保障捕获效率。