Nat Commun发表胚胎及新生儿期小鼠心脏单细胞转录组图谱，揭示先天性心脏病相关基因的细胞类型及阶段特异性富集
导语
心脏是哺乳动物胚胎发生过程中第一个发育的器官，其由四个腔室组成：左心房（LA）、右心房 （RA）、左心室（LV）和右心室（RV），每个腔室又由心外膜、心肌和心内膜三层组织组成。心肌由心肌细胞（CM）、成纤维细胞（Fb）和冠状动脉血管相关细胞类型组成；心外膜主要由心外膜细胞（Epi）组成，心内膜则含有心内膜/内皮细胞（Endo_EC）。在功能层面，Wilms’ tumor 1（Wt1）和T-Box转录因子18（Tbx18）是心脏发育的两个关键转录因子，其不仅在心外膜细胞中高度表达，在其他心脏谱系的早期阶段也有表达。
单细胞转录组测序（scRNA-seq）是在单细胞水平上研究心脏发育的有力方法。先前的研究已通过谱系追踪小鼠等鉴定了小鼠心脏的不同祖细胞群体和新的细胞亚群，但这些研究所囊括的细胞数量较少且大多数细胞是CM，限制了对非CM谱系的下游分析，而非CM谱系对心脏的发育和功能行使是至关重要的。因此，生成一个scRNA-seq数据集来捕获每一种主要的心脏细胞类型十分有必要。此外，对Wt1和Tbx18突变体的单细胞评估也将为了解心外膜在整个心脏发育过程中的功能提供见解。
近日，美国匹兹堡大学医学院的研究团队在Nature Communications发表了题为“Single-cell transcriptomic analysis identifies murine heart molecular features at embryonic and neonatal stages”的文章。研究团队使用多路复用策略（MULTI-seq），在保留发育阶段和腔室特性的情况下，对CD1小鼠中的72个样本和C57BL/6小鼠的68个样本进行了分析，生成了一个scRNA-seq数据集。通过系统的生物信息学分析，研究团队识别了每个细胞谱系中的发育阶段、腔室和细胞周期阶段特异性基因特征；发现了先天性心脏病（CHD）相关基因的细胞类型和阶段特异性富集。此外，研究团队还使用Wt1和Tbx18突变体揭示了心外膜源性生长因子在心脏发育过程中的功能。
文章发表在Nature Communications
主要研究内容
胚胎期和新生儿期心脏细胞类型鉴定
研究团队使用MULTI-seq分析了从E9.5到P9等多个阶段的心脏样本，这些阶段包括心脏的主要发育点，如四腔室的形成、冠状动脉血管的形成、出生和心肌细胞再生、丧失等。通过对单细胞转录组数据进行无监督聚类分析，将来自CD1和C57BL/6小鼠的细胞分为24个和27个亚群。
基于先前发表的数据和特征性基因的表达，研究团队注释了单细胞数据集中的细胞类型。基于泛CM基因Ttn、心房特异性CM基因Sln和心室特异性CM基因Myl2的表达，鉴定出代表心房CM（Atrial_CM）和心室CM（Ven_CM）的细胞亚群。基于泛EC基因Pecam1、心内膜EC基因Npr3和冠状动脉血管EC基因Fabp4的表达，研究团队发现了与心内膜EC（Endo_EC）、血管EC（vas_EC）相对应的亚群以及Wt1、Tbx18和Aldh1a2的高表达的Epi亚群。
此外，研究团队还根据Postn和Pdgfrb的表达分别定义了成纤维细胞样细胞（Fb_like）和壁细胞。有趣的是，依据平滑肌细胞基因Myh11和周细胞基因Pdgfrb的表达，壁细胞可以进一步分为平滑肌细胞（SMC）和周细胞。
图1. 胚胎和新生儿心脏发育的单细胞转录组图谱。来源：Nature Communications
发育阶段特异性分子的鉴定
在UMAP降维图上，研究团队观察到除壁细胞和免疫细胞外，所有细胞类型都是按发育阶段进行聚类的。大多数早期胚胎阶段的细胞聚集在UMAP图的一端，新生儿阶段的细胞聚集在另一端，晚期胚胎阶段的细胞分散在两者之间。
为确定每种细胞类型的阶段性分子特征，研究团队首先识别了在拟时序分析阶段差异表达的基因，并分析了由具有类似表达模式的基因表达模块。结果显示，大多数谱系定义基因模块在相邻阶段富集，并分为两类：早期胚胎期或晚期胚胎/新生儿期的组合。此外，早期阶段的模块中富集了与谱系发育和形态发生相关的基因；新生儿阶段的模块中主要包含与谱系成熟和细胞功能相关的基因。
图2. 基因表达模块在每种细胞类型中富集。来源：Nature Communications
CHD相关基因表达谱分析
该研究提供的scRNA-seq数据集包含了来自每个主要心脏发育阶段的心脏谱系细胞，在评估与CHD相关的基因表达模式方面具有重要价值。研究团队使用scRNA-seq数据集评估了一组已知的CHD相关基因，包括前期发表的涉及人类CHD的基因和导致小鼠CHD的基因。研究团队确定了能够显示细胞类型偏好表达模式的基因簇。
研究团队发现了一个在心房和心室CM中高度表达的基因簇，包括Nkx2-5、Myh6、Tbx5和其他10个基因，这些基因与CHD如房间隔缺损（ASD）和室间隔缺损（VSD）相关。Endo_EC基因簇有9个基因（包括Notch1和Foxc2），其在所有阶段都有表达并优先与左心发育不良综合征（HLHS）、双尖瓣主动脉瓣（BAV）和法洛四联症（TOF）相关。此外，研究团队还鉴定了Vas_ECs、壁细胞和免疫细胞的基因簇。
图3. 利用scRNA-seq数据分析冠心病基因的表达模式。来源：Nature Communications
Wt1和Tbx18突变体心外膜功能的研究
心外膜细胞是调节心脏发育的生长因子的枢纽。研究团队使用了两个携带心外膜转录因子Wt1和Tbx18突变的小鼠品系，通过MULTI-seq在多个阶段分析了两个突变体，以获得其缺陷的系统图谱。通过与对照组进行比较，研究团队在Wt1突变体中发现了一组异常表达的基因，包括Wt1、Aldh1a2、Rspo1、Tms4f5和Tm4sf1等。
接下来，研究团队比较了Wt1和Tbx18突变心外膜细胞中异常表达的基因，并在E14.5处确定了这两个突变体共享的一组基因。对共享基因进行富集分析发现，其在Wnt信号负调控和细胞外基质组装通路等多个通路中富集。此外，在这些共享基因中，生长因子包括Bmp4、Apoe和Cdh3在突变体中上调，而Wnt5a、ntnt和Tgfb2在突变体中下调。
图4. Wt1和Tbx18突变体对心脏发育的影响。来源：Nature Communications
结语
综上所述，研究团队使用MULTI-seq在单细胞层面分析了胚胎和新生儿阶段的心脏细胞，这个庞大的数据集可以作为将来研究哺乳动物心脏发育的优质资源。通过scRNA-seq分析两种心外膜表达转录因子Wt1和Tbx18的突变，研究了心外膜功能并发现了不同类型细胞的异常，对未来心脏生理和病理的研究具有重要意义。
参考文献：
Feng, W., Bais, A., He, H. et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies murine heart molecular features at embryonic and neonatal stages. Nat Commun 13, 7960 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35691-7
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