Genome Biol | 多种测序技术分析癌症参考细胞系中的结构变异，构建高置信度共识调用集
基因组不稳定性是癌症的关键标志之一，其由染色体易位、重复、插入/缺失、倒置以及拷贝数变异等导致。细胞中的结构变异（SV）可能会激活癌基因或阻断肿瘤调节基因。为了准确检测癌症、监测复发、制定精准的医疗策略和开发新的药物，准确检测体细胞SV至关重要。
近年来，由于单核苷酸水平的分辨率和高通量，NGS技术在体细胞SV检测中显示出巨大的临床应用前景。但人类基因组中的重复结构较多，使用NGS检测SV仍具有挑战性，因此，整合多种技术的数据对于准确检测SV是必要的。已有研究通过将长读长测序技术与RNA-seq相结合，在乳腺癌细胞系发现了超20,000种SV，但该癌细胞系中的关键突变特征，如单核苷酸变异（SNV）和小插入缺失（InDel），尚未得到较好的研究。
近日，美国弗雷德里克国家癌症研究实验室、洛马琳达大学基因组学研究中心等机构的研究人员合作在Genome Biology上发表了题为“Structural variant analysis of a cancer reference cell line sample using multiple sequencing technologies”的研究文章。研究团队通过多种NGS平台系统地研究了参考癌症细胞系中的体细胞SV，并将其与相匹配的正常细胞系进行比较，建立了一个包含1,788个SV的共识调用集，为提高癌症基因组SV检测的敏感性和准确性提供了参考。
文章发表于Genome Biology
为建立共识SV调用集并评估影响SV检测准确性的因素，研究团队选择了一个具有相匹配正常细胞系的乳腺癌细胞系（肿瘤HCC1395和正常HCC1395BL），该细胞系先前已被SEQC2联盟用于SNV分析。研究团队从5种NGS平台生成了测序数据，包括Illumina短读长测序、10X Genomics Linked-Reads、PacBio单分子长读长测序、Oxford Nanopore长读长测序和高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术（图1），对HCC1395和HCC1395BL的基因组覆盖率超6600X。
图1. SV检测和整合的流程。来源：Genome Biology
研究团队使用Survivir算法对HCC1395和HCC1395BL进行SV检测。结果显示，共有46,284个体细胞SV来自HCC1395，168,401个胚系SV来自HCC1395BL。进一步，研究团队整合了五个NGS平台的SV数据，去除了基因组中重叠的区域，并基于多个软件工具对其进行验证，最终获得高置信度的共识SV调用集。该调用集由1,788个SV组成，包括717个缺失、230个重复、551个插入、133个倒置和146个易位以及11个多断点事件。
每个平台的检测范围不同，每种软件算法也受到SV类型的限制。NGS技术的选择是决定SV检测准确性和灵敏度的主要因素之一。此外，研究团队还观察到不同技术和软件工具的体细胞SV检测一致性较低，但特定SV类型和大小检测存在一致性（图2），较小的SV检测比较大的SV检测更具一致性。
图2. 体细胞SV共识调用集。来源：Genome Biology
研究团队注意到，与Illumina、PacBio和10X Genomics平台检测到的小片段缺失事件相比，Illumina检测500bp-1kb范围内的片段缺失比例更高；对于长度为几千碱基至百万碱基的SV，PacBio、Nanopore和Hi-C技术比短读长测序和Linked-Reads技术具有更高的一致性。此外，长读长测序技术能够发现更复杂、更大型的SV，但这些SV往往会被短读长测序技术遗漏或误判（图3）。
软件算法的选择是影响SV检测准确性的另一个重要因素。此外，一些软件工具相互之间具有较高的一致性。例如，当用于PacBio和Nanopore SV检测时，PBSV、Sniffles和NanoSV高度重叠。同样，当利用Illumina短读长测序检测SV时，Manta、novoBreak和TNscope高度一致。
图3. HCC1395癌细胞系中不同NGS技术和软件工具的SV检测比较。来源：Genome Biology
为研究SV的功能，研究团队使用AnnoSV对共识SV进行了注释，确定了53个被确认为致病或可能致病的SV（包括缺失和重复事件）；与融合转录物相关的13个倒置和11个易位事件SV。研究团队提取了122个与共识SV重叠的癌症相关基因，发现高突变的基因如BARD1、MALT1、BRCA1/BRCA2、EIF3K、PTEN、FGFR2和MAP3K1，与一种或多种技术鉴定的肿瘤样本SV重叠（图4）。许多大型SV是同一区域内所涉及的几个较小SV组成的复杂事件。
图4. 参考样本中SV注释。来源：Genome Biology
为评估正常细胞混杂量（肿瘤纯度）和样本异质性的影响，研究团队以5、10、20、75和100%的肿瘤比例将肿瘤DNA掺入到正常DNA中。将Illumina WGS三次重复运行的读取数据汇总后，在每个细胞系上以100X覆盖率进行测序，以产生300X的覆盖率，数据集被二次采样为300X、200X、100X、80X、50X、30X和10X。研究团队比较了16,858个SV（包括6,431个大SV和10,453个小SV）中，基于肿瘤纯度、测序深度和SV类型的检测灵敏度（图5）。
当肿瘤纯度>20%时，SV检测的数量较高；当肿瘤纯度<20%时，SV检测灵敏度大幅降低。研究团队还比较了肿瘤纯度和测序深度对SV检测灵敏度的联合影响，当肿瘤纯度>50%时，低至30X的测序深度所检测到的SV百分比较高；但当肿瘤纯度较低时，则需要更高的测序深度，检测灵敏度和测序深度密切相关。
此外，为了评估不同平台的性能，研究团队比较了PacBio、Nanopore、Illumina、Bionano、10X Chromium和Hi-C调用的SV。总体相对灵敏度表明，Nanopore和PacBio-SV检测之间高度一致；Illumina SV检测与10X和Bionano中度一致，但10X和Bionano对Illumina SV检测的再现能力有限。
图5. 肿瘤纯度对SV检测灵敏度的影响。来源：Genome Biology
综上所述，研究团队结合多种测序技术对乳腺癌和正常细胞系进行深度测序，系统研究了SV检测，并开发了一个集成的SV调用集。通过比较多个技术/平台和不同的软件工具，研究团队建立了一个参考癌症样本高置信度的共识调用集，由1,788个SV组成。研究表明，多种技术的结合可以提高癌症基因组SV调用的敏感性和准确性。
参考文献：
Talsania K, Shen TW, Chen X, et al. Structural variant analysis of a cancer reference cell line sample using multiple sequencing technologies. Genome Biol. 2022;23(1):255. Published 2022 Dec 13. doi:10.1186/s13059-022-02816-6
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