基于牛津纳米孔GridION平台完成新冠病毒RNA直接测序，单条Read即可覆盖大部分病毒序列
新冠病毒肺炎疫情暴发以来，病毒基因组分析在公共卫生响应中发挥了至关重要的作用，病毒序列信息的快速共享也推动了相关基因组流行病学研究，为全球早日遏制病毒传播并完全攻克病毒提供了助力。基于公开共享的序列数据，现有研究表明新冠病毒在遗传学上的基因表达机制和分子进化速率可能与此前表征的冠状病毒相当。利用新冠病毒特异性数据对这些假设进行实验验证，将有可能进一步揭示这种新型病原体的生物学特性。
近日，预印本网站bioRxiv发布了澳大利亚墨尔本大学微生物和免疫学系Lachlan Coin和Sebastian Duchene团队及合作者的最新研究成果。研究团队报告了新冠病毒的第一个直接RNA序列，详细介绍了该冠状病毒亚基因组长度的mRNA结构，并基于共享数据揭示了新冠病毒进化遗传学的各个方面。
研究团队介绍，新冠病毒是一种冠状病毒科阳性单链RNA病毒，已知的冠状病毒通过一种负链不连续延伸的机制，产生多聚腺苷酸化的亚基因组长度的mRNA转录物嵌套集。这种机制能够产生不同长度的mRNA转录物，而用于RNA病毒的标准测序技术无法产生代表RNA病毒基因组或亚基因组长度的mRNA的reads，因为它们产生的reads长度较短，并且依赖于扩增以产生互补的DNA（cDNA）序列。
为了确定冠状病毒亚基因组长度的mRNA结构，研究人员使用了一种基于高度平行纳米孔阵列的RNA直接测序技术：从具有高水平新冠病毒培养材料中获取并制备核酸，并利用Oxford Nanopore Technologies公司的GridION平台上使用poly（T）接头和R9.4 flowcell进行了测序。
据悉，在40小时的测序过程中，病毒样品共产生了680,347个reads，包含了860Mb的序列信息。研究人员与培养的新冠病毒分离株（MT007544.1）基因组进行比对后发现，其中一部分reads属于冠状病毒序列（28.9％），共367Mb，分布在整个病毒基因组（29,893 bp）中。此外，许多reads长度大于20kb，单个分子测序数据就捕获了大部分新冠病毒基因组。总而言之，RNA直接测序提供了平均12230倍的新冠病毒基因组的覆盖范围，偏向聚腺苷酸3 '尾近端序列，这种偏向性反映了携带这些序列的亚基因组长度mRNA的丰度较高。
图：SARS-CoV-2遗传学和亚基因组长度的mRNA结构
研究人员表示，除了5 '帽结构的甲基化和3 '聚腺苷酸的高效翻译所需的病毒编码序列，其他RNA修饰也可能在新冠病毒中发挥功能作用。通过对RNA直接序列数据分析，研究人员还确定了42个具有可预测的5-甲基胞嘧啶修饰的位点，这些位点在亚基因组长度的mRNA之间呈现一致的位置。在其他阳性单链病毒中，RNA甲基化在感染过程中会发生动态变化，影响宿主与病原体之间的相互作用和病毒复制。
此外，除了研究新冠病毒遗传学的假定特征，研究人员还基于序列数据估算了其分子进化速率。研究人员精选了一组高质量的公共新冠病毒基因组序列进行了贝叶斯系统发育分析，结果显示与流行病学证据和其他近期分析结果一致。
总而言之，通过使用RNA直接测序数据，该研究进一步揭示了新冠病毒的分子生物学信息，为更详细了解病毒亚基因组长度mRNA的结构提供了宝贵信息。
注：bioRxiv所有论文未经同行评议
参考资料：
1. Direct RNA sequencing and early evolution of SARS-CoV-2
https://doi.org/10.1101/2020.03.05.976167
2. 中国科学院. 科学家首次实现对新冠病毒RNA直接测序
http://www.cas.cn/kj/202003/t20200311_4737343.shtml
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