揭秘一种快速鉴定COVID-19和A型/B型流感的新方法：RPA
题目：Development of a multi-recombinase polymerase amplification assay for rapid identification of COVID-19, influenza A and B
为了提高对COVID-19和流感的诊断水平，新建立了一种简便、快速扩增SARS-CoV-2的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法。选择H1N1的基质蛋白（M）、H3N1的血凝素（HA）、B型流感的聚合酶A（PA）、开放阅读框1AB（ORF1ab）区的核衣壳蛋白（N）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）和SARS-CoV-2的包膜蛋白（E）等基因，设计了特异性引物。使用SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和B型流感病毒质粒标准以及从COVID-19和A型/B型流感阳性患者中提取的RNA样本验证RPA方法。
使用RPA方法分析了一系列10倍稀释的SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和B型流感质粒DNA，每次反应的范围从1拷贝到10000拷贝不等。在39 ℃的30分钟内，使用引物组N、ORF1ab和E，检测的灵敏度分别为每个反应2拷贝、3拷贝和3拷贝；使用引物组M、HA和PA，检测的灵敏度分别为1拷贝、1拷贝和1拷贝。SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和B型流感病毒RPA检测的检出限分别为300拷贝/ml、100拷贝/ml、100拷贝/ml和100拷贝/ml。
图1. RPA法测定SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和B型流感病毒的敏感性
为了验证RPA方法的特异性，对来自流感和B型流感的PBS、RNA和5份COVID-19阴性样本进行了RPA分析。所选择的引物仅扩增了SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和IVB基因，与H5N1、H7N9、B型流感、H CoV-229E、H CoV-MES、H CoV-SARS、H CoV-OC43或14种细菌或PBS阴性对照没有交叉反应。这些结果证实了用优化的引物组建立的RPA方法对SARS-CoV-2、H1N1、H3N2和B型流感的检测是特异的。
图2. 不同样品的特异性验证
一般来说，实验室确诊阳性病例需要同一标本中新型冠状病毒2型靶点（ORF1ab, N）实时RT-PCR均为阳性。为了获得更准确的结果，研究者将3个基因（N、E和ORF1ab）组合用于SARS-CoV-2的检测，并将3个基因（M、HA和PA）分别用于H1N1、H3N2和B型流感的检测。结果显示，RPA检测结果与qPCR符合率为100%，说明所建立的RPA检测方法在COVID-19和A、B型流感的检测中具有重要作用。
研究者新开发了一种基于RPA方法的准确、快速诊断COVID-19和流感的方法。当N、ORF1ab和E基因的特异性为96.67%、96.67%和100%，M、HA和PA基因的特异性为100%、100%和90%时，该检测方法显示出区分COVID-19和流感患者与健康对照组的敏感性为100%。该方法有可能用于筛查COVID- 19和流感，在资源匮乏的环境中作为RT - PCR或LAMP的替代方法用于监测感染。
Liang LG, Zhu MJ, He R, et al. Development of a multi recombinase polymerase amplification assay for rapid identification of COVID 19, influenza A and B[J]. J Med Virol. 2022 Sep 11;10.1002/jmv.28139.
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