影响因子9.043丨分享一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的mcr-1检测方法

发布时间：2022-12-07 14:50:04 I 企业名称：江苏东抗生物医药科技有限公司 I 作者：

研究背景

质粒介导的可移动粘杆菌素耐药酶（mobilized colistin resistance，mcr-1）基因可导致耐药株的快速传播，给人类感染的治疗带来极大威胁。本研究将RPA与CRISPR/Cas12a系统相结合，建立了一种新的快速检测mcr-1基因的方法，命名为RPA-CRISPR/Cas12a，并阐述了该方法在无菌培养和模拟样品中的特异性和敏感性。

图1. 用于mcr-1检测的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法概述

研究思路和结果

基于RPA-CRISPR/Cas12a的mcr-1检测

含有PAM位点（TTTC）的目标基因段被RPA试剂盒在37℃的等温条件下扩增（图1，步骤1和2）。由重组酶和特异性引物结合形成的重组酶-引物复合物可以在双链DNA模板中寻找同源序列。当模板的特异性序列被识别后，链式交换反应将被启动，目标片段将在DNA聚合酶的作用下被成指数级扩增。在检测阶段，gRNA-CRISPR/Cas12a复合物通过PAM位点识别目标序列（图1，步骤3），成功激活效应分子Cas12a。然后，被激活的Cas12a蛋白切割目标序列，同时在反应体系中实现探针（用荧光团标记的ssDNA）的非特异性反式切割（图1，步骤4至6）。最后，荧光信号被释放出来，可以作为检测结果的指标被收集。

RPA-CRISPR/Cas12a检测的整个诊断过程，包括基因组提取（15分钟）、RPA反应（30分钟）、CRISPR/Cas12a裂解（5分钟）和荧光检测（10分钟），可以在1小时内完成（图2）。

图2. 用于mcr-1检测的RPA-CRISPR/Cas12a工作流程示意图

RPA-CRISPR/Cas12a系统对mcr-1的敏感度和特异性评估

使用参考菌株（E. fergusonii WH-ZX154）的连续稀释液评估了RPA-CRISPR/Cas12a系统的检测极限。CRISPR-mcr-1检测按上述方法执行，并通过检测荧光信号获得结果。最后，通过三次平行试验，该系统甚至可以稳定地检测420 fg的质粒DNA。为了分析RPA-CRISPR/Cas12a系统的特异性，提取了携带各种抗性基因（KPC-2、NDM-1、IMP-26、OXA-181、rmtB、qnrS1、TEM-1B和sul1）菌株的DNA。与这些非mcr-1物种相比，只在产生mcr-1的样本中检测到阳性信号。RPA-CRISPR/Cas12a技术的阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、敏感性和特异性都是100%。因此，开发的RPA-CRISPR/Cas12a系统可以专门监测mcr-1基因。

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Cat.No.	Product Name
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E03301	Bsu DNA Polymerase，Large Fragment
E04301	Gss DNA Polymerase
E03401	T4 gene 32 protein
E04401	Recombinase A
E03501	T4 UvsX Recombinase
E03601	T4 UvsY Protein
E04501	Creatine Kinase
E04601	T4 polynucleotide kinase

表1.东抗生物等温扩增酶系列产品介绍

参考文献

Gong L, Jin ZJ, Liu E, et al. Highly Sensitive and Specific Detection of Mobilized Colistin Resistance Gene mcr-1 by CRISPR-Based Platform[J]. Microbiol Spectr. 2022 Oct 26;10(5):e0188422.

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