iStop基因敲除技术服务

 

     iStop技术基于CRISPR单碱基基因突变技术CBE（CRISPR-dependent cytosine base editor）（1）。CBE技术在不依赖DNA双链断裂的前提下，特异性实现基因组C>T碱基突变，将CBE技术应用于基因敲除时，可以实现精确地将四个密码子（CAA、CAG、CGA 和 TGG）转换为终止密码子（TAA、TAG、TGA）（图1）。

 

 

 图1 iStop技术原理（图片来源：Kuscu, Cem, et al. "CRISPR-STOP: gene silencing through base-editing-induced nonsense mutations." Nature methods 14.7 (2017): 710-712.）

 

 与CRSIPRCas9移码突变基因敲除技术相比，iStop基因敲除技术更加精确，对DNA损伤小，不易引起临近基因表达改变以及DNA大片段缺失（2）。

 

我们提供以下iStop基因敲除技术服务：
1、iStop基因敲除sgRNA表达载体构建
服务编号：SK01
服务价格：1800元/靶点
周期：2周

 

服务内容：客户提供靶点序列。我方构建该靶点表达载体。

服务标准：载体测序结果与设计一致。

服务适用：本服务适用于已有有效靶点的客户。靶点可以来自可靠的文献资料或者客户自己验证的结果。客户需自备CRISPRCBE基因编辑载体或者在我司购买。

 

2、iStop基因敲除靶点筛选及载体构建服务
服务编号：SK02
服务价格：4500元/套
周期：4周

 

服务内容：设计并构建3-5个靶点表达载体，与CRISPRCBE载体一起瞬转HEK293V细胞。基因组PCR测序验证靶点基因敲除效率。提供至少一个有效靶点及有效靶点的sgRNA表达载体。

服务标准：1、载体测序结果与设计一致。2、基因组PCR测序结果确定靶点有效。

服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有丰富的细胞培养转染、细胞单克隆筛选和检测经验的客户。客户需自备CRISPRCBE基因编辑载体或者在我司购买。

 

3、iStop基因敲除多克隆细胞株服务
服务编号：SK03
服务价格：8800元/株（HEK293）；9800元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价
周期：6-8周

 

服务内容：前期靶点设计及验证同SK02。验证完成后转染细胞株并用抗生素筛选阳性克隆，基因组PCR测序验证基因敲除效果。提供含基因敲除阳性细胞的细胞pool。

服务标准：基因组PCR测序结果确定基因敲除有效。

服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有细胞单克隆筛选和检测经验的客户。

 

 

4、iStop基因敲除单克隆细胞株服务
服务编号：SK04
服务价格：14000元/株（HEK293）；18000元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价
周期：12-14周

 

服务内容：筛选多克隆株同SK03。获得多克隆株后通过有限稀释法分选单克隆细胞株。基因组PCR测序检测单克隆株基因敲除结果。提供含目的基因双等位基因敲除单克隆细胞株。

服务标准：基因组PCR测序结果验证敲除成功。

服务适用：本服务适用于经费充足，实验人手不足的客户。

 

 

服务优势：

  1)技术成熟。我司具有多年的基因编辑技术经验和稳转细胞株构建服务经验，可提供从项目设计到实施的完整服务。

2)已制备多种Cas9蛋白突变体，进一步扩展了CRISPR基因敲除的靶点选择范围，基本上现有基因均可设计iStop基因敲除靶点。

 

 

iStop基因敲除实例：在HEK293V细胞株敲除CD274基因

1.靶点设计及筛选

    由于CD274基因蛋白仅有274个氨基酸，编码序列较短，采用常规Cas9的NGGPAM序列设计靶点较为困难。我们采用了Cas9的突变体Cas9-spRY进行实验。Cas9-spRY的PAM序列为NRY，大幅增加了可选择的靶点数量。

设计的靶点序列如下：

靶点编号		DNA序列	氨基酸序列
1	编辑前	aaaacaattagacctggctg cac	EKQLDLAA
	编辑后（理论）	aaaataattagacctggctg cac	EK*LDLAA
2	编辑前	ttattcaatttgtgcatgga gag	IIQFVHGE
	编辑后（理论）	ttatttaatttgtgcatgga gag	II*FVHGE
3	编辑前	aaggttcagcatagtagcta cag	KVQHSSYR
	编辑后（理论）	aaggtttagcatagtagcta cag	KV*HSSYR
4	编辑前	aaggaccagctctccctggg aaa	KDQLSLGN
	编辑后（理论）	aaggattagctctccctggg aaa	KD*LSLGN

 

 

2.靶点设计及筛选瞬转HEK293V细胞筛选靶点

     构建好的4个靶点表达载体与Cas9-SpRY-CBEMax载体共转染HEK293V细胞。提取细胞基因组，进行PCR测序。结果如下：

 结果显示靶点1、2没有效果。靶点3、4突变效果明显。

 

3.采用靶点3制备单克隆细胞株，并且对细胞克隆的CD274基因进行基因组PCR测序检测。

结果显示该克隆中CD274基因敲除成功

 

参考文献：
（1）Billon, Pierre et al. “CRISPR-Mediated Base Editing Enables Efficient Disruption of Eukaryotic Genes through Induction of STOP Codons.” Molecular cell vol. 67,6 (2017): 1068-1079.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.08.008
（2）Dang L, Li G, Wang X, et al. Comparison of gene disruption induced by cytosine base editing-mediated iSTOP with CRISPR/Cas9-mediated frameshift. Cell Prolif. 2020;53(5):e12820. doi:10.1111/cpr.12820