BCA蛋白定量试剂盒

货号	160000003	保存	见下表（包装清单）
规格	500 T(微孔法)

包装清单：

1. 原理

BCA蛋白定量法一种快速便捷、准确可靠的蛋白含量测定方法，实现了蛋白浓度测定的简单、高稳定性、高灵敏度和高兼容性。

该方法的原理是在碱性环境下，蛋白质可以将Cu ²⁺还原为Cu⁺（缩二脲反应），并由二辛可宁酸（BCA）检测亚铜阳离子 (Cu⁺)。在该双缩脲反应（反应）中，由三个或更多氨基酸残基的肽在碱性环境中与铜离子结合形成亚铜阳离子。BCA 与形成的还原型（亚铜）阳离子发生反应。两分子 BCA 与一个亚铜离子螯合，产生深紫色的反应产物在562 nm处具有强线性吸收，且吸收度随蛋白质浓度增加而升高，通过与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

检测浓度下限达到1.0 μg/ml，最小检测蛋白量达到0.02 μg，待测样品体积为1-20 μl。在1.0-20000 μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。每个试剂盒可以检测500个样品(含标准曲线孔)。

BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的 Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用其他蛋白浓度检测方法。

2. 实验材料

能检测562 nm吸光值的酶标仪一台，96孔板或酶标板条以及酶标板条架。如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但测定时，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大BCA工作液的用量，不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例放大也可不变。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量会显著减少。
3. 实验步骤

（1）微孔酶标仪法

①BCA工作液配制

每个样品需要200 µl的BCA工作液，根据样品数量，配制BCA工作液的体积比样品需要BCA工作液体积多~5%，避免分液时损失导致工作液体积不足。

在干净的容器中加入BCA试剂A，然后加入1/50体积的BCA试剂B，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后会消失)。例如5 ml的BCA试剂A加100 μl BCA试剂B，混匀，配制成5.1 ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

②标准孔准备

参照下表在标准孔的微孔中分别加入20、19、18、16、12、8、4、0 μl的1×PBS，然后在对应的孔中分别加入0、1、2、4、8、12、16、20 μl的BSA蛋白标准品，相当于标准品浓度分别为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml。

1×PBS体积(μl)	BSA蛋白标准品体积(μl)	BCA工作液(μl)	BSA浓度 (μg/ml)
20	0	200	0
19	1	200	25
18	2	200	50
16	4	200	100
12	8	200	200
8	12	200	300
4	16	200	400
0	20	200	500

③样品孔准备

通常在每个样品孔中加入16 μl的1×PBS，然后加入4 μl的待测样品进行检测。对于浓度很高的样品，建议先稀释20倍之后，再取4 μl加入到16 μl的1×PBS中进行检测。

④加标准液

向标准孔和检测孔中加入200 μl的BCA工作液，37℃放置30分钟。

（说明：反应也可于室温2小时进行，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。）
⑤检测

用酶标仪测定标准孔和各样品孔在562 nm的吸光值。

⑥待测样品浓度计算

根据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品的蛋白浓度。

（2）分光光度计法

①BCA工作液配制

每个样品需要2 ml的BCA工作液，根据样品数量，配制BCA工作液的体积比样品需要BCA工作液体积多~5%，避免分液时的损失导致工作液体积不足。

在干净的容器中加入BCA试剂A，然后加入1/50体积的BCA试剂B，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。例如50 ml的BCA试剂A加1 ml BCA试剂B，混匀，配制成51 ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

②标准孔准备

取8支5 ml的离心管，参照下表分别加入200、190、180、160、120、80、40、0 μl的1×PBS，然后在对应的孔中分别加入0、10、20、40、80、120、160、200 μl的BSA蛋白标准品，相当于标准品浓度分别为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml。

1×PBS体积(μl)	BSA蛋白标准品体积(μl)	BCA工作液(ml)	BSA浓度 (μg/ml)
200	0	2	0
190	10	2	25
180	20	2	50
160	40	2	100
120	80	2	200
80	120	2	300
40	160	2	400
0	200	2	500

③样品离心管准备

通常在每个待测样品的离心管中加入195 μl的1×PBS，然后加入5 μl的待测样品进行检测。

④加标准液

向标准孔和检测孔中加入2 ml的BCA工作液，37℃放置30分钟。

（说明：反应也可于室温2小时进行，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。）
⑤检测

将标准管和样品管中的液体分别取等量加入到比色皿中，用分光光度计测定标准管和各样品管在562 nm的吸光值。

⑥待测样品浓度计算

根据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品的蛋白浓度。

注意事项： 

1. BCA 试剂A在低温条件下出现结晶沉淀时，可 37℃温育使其完全溶解, 不影响使用。

2. 本产品仅限于科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。