2×SYBR qPCR Master Mix
2×SYBR qPCR Master Mix		Cat.No. 102000011
(Universal)		Size: 1.0 ml×5
		Store: -20 °C&Dark

产品概述

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分Q3 Taq DNA Polymerase为一种新型的配体法热启动DNA聚合酶，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR Green I的2×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适应于所有qPCR仪器，无需在不同的机型上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增，操作简便！

产品组分

包含：dNTP, Mg²⁺, Q3 Taq DNA Polymerase, SYBR Green I, ROX Passive Reference Dye等。

适用机型

本产品使用独特的ROX PassiveReference Dye，适用于所有qPCR仪器（无ROX校正机型；低浓度ROX校正机型；高浓度ROX校正机型)，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度。适用如下机型：

Applied Biosystems 5700，7000，7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast，StepOne™，StepOnePlus™，7500，7500 Fast，ViiA™7；Bio-Rad CFX96™，CFX384™，iCycler iQ™，iQ™5，MyiQ™，MiniOpticon™，Opticon^®，Opticon 2，Chromo4™；Qiagen/Corbett Rotor-Gene^® Q，Rotor-Gene^®3000，Rotor-Gene^® 6000；Stratagene MX4000™，MX3005P™，MX3000P™；Eppendorf Mastercycler^® ep realplex，realplex 2s；Roche Applied Science LightCycler™ 480以及其他市场上常见的荧光定量PCR仪。

保存条件

 -20°C避光保存；Master Mix解冻后可于2 ~ 8°C避光条件下稳定存放6个月。

♦ Master mix解冻后可能出现些许白色沉淀，室温放置片刻并上下颠倒，沉淀即会溶解。请确认沉淀完全溶解，并充分混匀后使用。

实验流程

1.在qPCR管中配制如下混合液

2 xSYBR qPCR Master Mix	10 μL
Primerl (10 μM)	0.4 μL
Primer2 (10 μM)	0.4 μL
Template DNA/cDNA	X μL
ddH2O	To 20 μL

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：

♦—般来说反应体系中引物终浓度为0.2 mM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围内（0.1-1.0 μM）调整引物浓度。

♦ qPCR敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

♦如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

2.按下列条件进行qPCR反应

Stage 1	预变性A	Cycle: 1	95 °C	30 sec
Stage 2	循环反应B	Cycle: 40	95 °C	10 sec
			60 °C	30 sec
			95 °C	15 sec
Stage 3	融解曲线C	Cycle: 1	60 °C	60 sec
			95 °C	15 sec

A:该预变性条件适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至3 min提高预变性效果。

B:300 bp以内的扩増子，延伸时间设置为30 sec即可；超过300 bp的扩增子，推荐延长延伸时间至60 sec。

C.仪器类型不同，融解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可

质置控制

纯度检测：所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、核酸残留。

功能检测：以质粒或者HeLa细胞总RNA逆转录产物的稀释液为模板，扩增5个基因，每个基因的融解曲线为单峰，特异性好。

反应体系优化方案

优秀的反应体系应具备以下特征：融解曲线单峰（扩增特异性）、扩增效率接近100%（扩增效率）、CT值小（扩増灵敏度）。如使用默认反应条件性能不佳时，可根据下述方案进行优化。

1.引物浓度与反应性能之间的关系：当引物终浓度在0.1-1.0 μM范围之间变化时，引物浓度越高，扩增特异性越差，但扩増效率越高。

2.扩增程序与反应性能之间的关系：

如需提高扩增特异性，可提高退火温度：

 

2×SYBR qPCR Master Mix
2×SYBR qPCR Master Mix		Cat.No. 102000011
(Universal)		Size: 1.0 ml×5
		Store: -20 °C&Dark

产品概述

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分Q3 Taq DNA Polymerase为一种新型的配体法热启动DNA聚合酶，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR Green I的2×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适应于所有qPCR仪器，无需在不同的机型上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增，操作简便！

产品组分

包含：dNTP, Mg²⁺, Q3 Taq DNA Polymerase, SYBR Green I, ROX Passive Reference Dye等。

适用机型

本产品使用独特的ROX PassiveReference Dye，适用于所有qPCR仪器（无ROX校正机型；低浓度ROX校正机型；高浓度ROX校正机型)，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度。适用如下机型：

Applied Biosystems 5700，7000，7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast，StepOne™，StepOnePlus™，7500，7500 Fast，ViiA™7；Bio-Rad CFX96™，CFX384™，iCycler iQ™，iQ™5，MyiQ™，MiniOpticon™，Opticon^®，Opticon 2，Chromo4™；Qiagen/Corbett Rotor-Gene^® Q，Rotor-Gene^®3000，Rotor-Gene^® 6000；Stratagene MX4000™，MX3005P™，MX3000P™；Eppendorf Mastercycler^® ep realplex，realplex 2s；Roche Applied Science LightCycler™ 480以及其他市场上常见的荧光定量PCR仪。

保存条件

 -20°C避光保存；Master Mix解冻后可于2 ~ 8°C避光条件下稳定存放6个月。

♦ Master mix解冻后可能出现些许白色沉淀，室温放置片刻并上下颠倒，沉淀即会溶解。请确认沉淀完全溶解，并充分混匀后使用。

实验流程

1.在qPCR管中配制如下混合液

2 xSYBR qPCR Master Mix	10 μL
Primerl (10 μM)	0.4 μL
Primer2 (10 μM)	0.4 μL
Template DNA/cDNA	X μL
ddH2O	To 20 μL

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：

♦—般来说反应体系中引物终浓度为0.2 mM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围内（0.1-1.0 μM）调整引物浓度。

♦ qPCR敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

♦如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

2.按下列条件进行qPCR反应

Stage 1	预变性A	Cycle: 1	95 °C	30 sec
Stage 2	循环反应B	Cycle: 40	95 °C	10 sec
			60 °C	30 sec
			95 °C	15 sec
Stage 3	融解曲线C	Cycle: 1	60 °C	60 sec
			95 °C	15 sec

A:该预变性条件适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至3 min提高预变性效果。

B:300 bp以内的扩増子，延伸时间设置为30 sec即可；超过300 bp的扩增子，推荐延长延伸时间至60 sec。

C.仪器类型不同，融解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可

质置控制

纯度检测：所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、核酸残留。

功能检测：以质粒或者HeLa细胞总RNA逆转录产物的稀释液为模板，扩增5个基因，每个基因的融解曲线为单峰，特异性好。

反应体系优化方案

优秀的反应体系应具备以下特征：融解曲线单峰（扩增特异性）、扩增效率接近100%（扩增效率）、CT值小（扩増灵敏度）。如使用默认反应条件性能不佳时，可根据下述方案进行优化。

1.引物浓度与反应性能之间的关系：当引物终浓度在0.1-1.0 μM范围之间变化时，引物浓度越高，扩增特异性越差，但扩増效率越高。

2.扩增程序与反应性能之间的关系：

如需提高扩增特异性，可提高退火温度：

 

 

常见问题与解决方案

1.扩增曲线形状异常

扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点（CT值4），重新分析数据。

个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

2.反应结束无扩增曲线出现

反应循环数不够：一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解。

模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

模板降解：重新制备模板，重复实验。

3.CT值出现太晚

扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。

板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

模板降解：重新制备模板，重复实验。

PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80 bp-150 bp。

体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

4.阴性对照出现明显扩增

反应体系污染：更换新的Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置，减少气溶胶污染。

引物二聚体的出现：配合融解曲线进行分析。

5.绝对定量时标准曲线线性关系不佳

加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。

标准品降解：重新制备标准品，重复实验。

模板浓度太高：提高模板稀释倍数。

6.融解曲线出现多峰

引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。

引物浓度太高：适当降低引物浓度。

cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。

7.实验重复性差

加样体积不准：使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。

定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

注：For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.     产品仅供科研使用，不用于临床诊断。