产品简介：

     sgRNA体外转录试剂盒采用T7 RNA聚合酶复合物高效转录spCas9sgRNA。试剂盒中的反应体系根据sgRNA特点进行优化，每个反应可在4小时内获得多达100-200μg的sgRNA。sgRNA可直接用Cas9蛋白体外切割，纯化后可用于细胞注射等实验。

试剂盒中配备了合成sgRNA转录模板，sgRNA转录所需的全部试剂，用户仅需要合成含有1条CRISPR靶点的引物就能完成sgRNA体外转录。

 

产品内容：

储存条件：-20℃冻存

使用前必读注意事项： 
！务必使用无RNA酶的枪头、离心管配制转录反应体系。

1、制备转录模板 
1.1 设计PCR正向引物： 
spCas9识别的靶点为20nt+NGG共23个碱基序列，我们以阳性对照的靶点序列为例说明设计引物的方法。

阳性对照的靶点序列为： 
5’CTGCTAATCCTGTTACCAAGTGG-3’

 

需要合成的正向引物序列为： 
5’- TTAATACGACTCACTATAGGGCTGCTAATCCTGTTACCAAG GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’

 

 

1.2 PCR扩增转录模板 
反应体系：

正向引物（10 μM）                              0.8μl

SG-R primer                                         0.8μl

PCR template DNA                              0.5 μl 

2×PCR Mix                                          10μl 

H2O                                                     7.9μl

 

 

 

阳性对照反应：

Positive control Primer（10 μM）     0.8μl 

SG-R primer                                      0.8μl  

PCR template DNA                           0.5 μl  

2×PCR Mix                                       10μl 

H2O                                                  7.9μl

 

 

反应条件： 
95℃ 5min
95℃ 30sec
56℃ 30sec    35 cycles
72℃ 30sec

扩增产物为117bp。扩增完成后用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

 

 

2、sgRNA转录 
操作过程中采用无RNA酶的吸头及离心管操作，并注意避免RNA酶污染。 

 

 

2.1 转录反应 
按顺序加入以下反应物： 

 

（1）反应体系:

无RNA酶水                                       to 20 μl 

5×Transcription Buffer                 4 μl 

NTP mix                                        8 μl 

PCR产物                                        2 μl 

T7 Transcription Enzyme mix       2 μl 

 

*20ul体系sgRNA产量为100-200ug。如果下游实验所需sgRNA量较少，可以根据需要适当调整体系，但尽量不低于5ul。 

（2）转录条件：充分混匀，37℃孵育4小时。 
*孵育时尽量采用PCR仪等带有热盖的仪器，或者在37℃恒温培养箱反应。切勿使用水浴锅。

（3）转录完成后取少量反应液，稀释20倍后用琼脂糖凝胶电泳检测产物大小及完整性。

 

 

电泳方法：
(1) 取1μl转录产物，加入19μl无RNA酶水，混匀（稀释20倍）。

(2)取3μl稀释后样品，加入3μl 2×RNALoading Buffer。70℃加热10min，立即放置冰上。

(3)用2%琼脂糖凝胶电泳检测条带。

 

3、转录产物纯化 
* 转录产物可以直接用于Cas9体外酶切反应。纯化步骤选做。 
* 转录模板DNA对Cas9体外酶切没有影响，可以不用去除。如果要去除模板DNA，可以先用     DNase I消化转录反应液，再进    行纯化。 
* 可以选用可靠公司生产的RNA纯化试剂盒进行纯化或者乙醇沉淀纯化。乙醇沉淀纯化方法见 电子版说明书。

 

4、RNA定量 
转录得到的sgRNA可以采用紫外分光光度计定量。一般20μl体系可以得到sgRNA 100~200μg

 

 

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