Frdbio® 荧光素Fluor488标记试剂盒
- ARL0520
- Frdbio
- 湖北省武汉市
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- 2022-07-27 16:32:34
福因德科技（武汉）有限公司
产品介绍
Frdbio® Fluor荧光染料为活性荧光染料，该系列包括从紫外、可见光谱到近红外光谱常见荧光染料，用于标记生物分子，特别是蛋白质和核酸。对核心结构的创新性修改使得Frdbio® Fluor染料优于具有许多创新新颖特征的其他商业染料，主要表现在标记效率更高，发光度更强。
Frdbio®Fluor488是一种荧光染料，其激发波长和发射波长分别为494nm和518nm，它与抗体形成更特异的抗体荧光素结合物，背景较更低;FITC升级产品，主要表现在稳定性更好。
基本原理
本试剂盒主要通过荧光素集团的活性键与生物分子的游离氨基共价结合，可以用于标记抗体，蛋白。本试剂盒种所提供的荧光染料都为预先活化干粉，便于长期保存，使用时用试剂盒随带的DMSO溶解便可直接用于标记实验，60-90分钟可以轻松完成标记。标记产物在含有防腐剂的保存液中可以放置在 4˚C至少保存1个月以上，需要长期保存。
本试剂盒常被用于抗体的直接标记，省却了二抗的使用和其所带来的操作步骤。
试剂盒组分
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组分名称（Components） |
型号规格及其对应组分 |
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ARL0520K-200 |
ARL0520K-500 |
ARL0520K-1000 |
其他规格可洽定制 |
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可标记抗体量 |
0.2~1.0mg |
0.5~2.5mg |
1.0~5.0mg |
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活化Fluor488干粉 |
使用时加DMSO 40ul溶解 |
使用时加DMSO 100ul溶解 |
使用时加DMSO 200ul溶解 |
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DMSO |
40ul |
100ul |
200ul |
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标记缓冲液(Coupling buffer) |
10mL |
15mL |
30mL |
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标记物保存液(Preservation Buffer) |
2.0mL |
2mL*2 |
10mL |
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纯化超滤管: |
1支 |
1支 |
1支 |
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重要提示：
1. 本试剂盒所配置的活化Fluor488荧光染料为干粉，可放置4˚C或者-20˚C长期保存，使用时加入试剂盒所配的DMSO溶解即可用于标记，溶解后的Fluor488荧光染料不可保存下次使用，建议一次性使用完；
2. 本试剂盒所配置的超滤管默认截留30k MWCO,适合于抗体抗体，如果需要标记其他分子量蛋白类物质请与我们联系，给您配置相应分子量截留超滤管（您的待标记物质分子量必须大于超滤管截留分子量的2倍以上）；
3. 本试剂盒所推荐的抗体标记量仅供参考，如有更高要求需要实验者具体摸索优化，建议按照推荐最低量进行标记实验。
4. 对待标记抗体、蛋白质的要求：
ü 待标记物以0.01M pH7.4 PBS环境为佳，不应含有甘油、BSA、叠氮钠、氨基物质（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物质。如果含有以上小分子物质，需用0.01M pH7.4 PBS 缓冲溶液进行充分透析、脱盐柱脱盐或者超滤管超滤置换溶液以除去干扰小分子，如果含有保护性蛋白BSA等需要想办法将其分离去除；
ü 调整待标记物至适当的浓度，抗体调整的浓度为2-10mg/mL为宜；对于小分子物质需要实验者摸索浓度，保证荧光素的比例过量。
ü 最佳标记反应条件为试剂盒所提供的标记缓冲液环境，尽可能在标记前将待标记物溶液环境置换为标记还缓冲液；
ü 如果待标记物溶液中有不溶物、有块状物或者沉淀请离心或者过滤除掉。
其他需要自备材料：
ü 待标记的生物分子
ü 移液器及吸头.
ü 去离子水.
ü PBS (pH 7.4)
试剂盒储存
试剂盒放在-20˚C可保存6个月以上。.
试剂盒使用操作流程
Ø 试剂准备
待标记的生物分子与荧光素最佳摩尔比例为1:8-1:22,本试剂盒推荐最佳比例为1:15（按照本试剂盒操作荧光素干粉加入相应量DMSO溶解后的荧光素浓度770uM(nmol/ml),通常1mg/ml抗体(分子量150kDa)的浓度为6.67uM(nmol/ml)； 为了获得最佳的摩尔比例，可以要通过预实验进行摸索。以抗体标记为例，推荐量如下。最佳标记体系应保证抗体的浓度为2mg/ml，标记时终浓度不低于1mg/ml。对于其他标记量，参照表按等比例调整抗体的体积和用量。
Ø 样品准备
待标记的分子浓度不低于2 mg/ml，如果浓度较低，需在实验之前浓缩到2mg/ml以上；待标记的分子需要溶解在符合以下要求的缓冲液中，如果符合以下要求可以直接进行标记，如果不符合请将溶液置换（透析或者超滤）到符合要求的溶液中在进行标记实验。
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pH |
6.5-8.0 |
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不含游离氨基 |
MES, PBS, HEPES |
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螯合剂 (e.g. EDTA) |
ü |
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甘油 |
< 5% |
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牛血清白蛋白 |
✗ |
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甘氨酸 |
✗ |
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含氨基组分 |
✗ |
Ø 操作流程(以标记100ug抗体为例,2mg/ml)
1) 将待标记抗体溶液置换成标记缓冲液，或者加入1/10体积标记缓冲液，用移液器轻轻混匀；
2) 取20ul(按照抗体与荧光素摩尔比=1:23)活化的Fluor488溶液加入到上述步骤混匀的抗体中，轻轻混匀，37℃ 避光反应1小时；
3) 反应完毕，将适量的PBS（约450uL）加入到步骤2)的混合溶液中，轻轻混匀并将溶液移至超滤管芯，4℃ 12000离心5min；
4) 离心完毕，取出管芯将外套管内溶液弃掉，管芯重新插入外套管，在管芯内重新加入适量的PBS（约450uL）4℃ 12000离心5min；
5) 重复步骤4）5次以上；
6) 将超滤管芯内溶液轻轻混匀并吹打管心内壁，并转移到干净避光离心管，此即为荧光素标记产物。
Ø 标记产物的保存
根据实验需要调整到合适的浓度，可加入适量BSA，甘油及防腐剂等，分装成小分-20℃避光保存；也可以将试剂盒附带的标记物保存液与标记产物按照体积比1：1混匀后，即可分装保存。
Flour 488标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和494nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A494×0.11))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A494×稀释倍数/(71000×蛋白摩尔浓度)
常见问题及解决办法
Q: 待标记分子经过浓缩浓度仍然达不到2 mg/ml，再浓缩就产生沉淀了怎么办?
A: 标记的时候尽可能达到这个浓度，如果实在达不到这个浓度，适当增加加入的活化的荧光素的量；最佳标记效果可以梯度增加荧光素用量试验测试来确定。
Q: 待标记分子与荧光素的最佳摩尔比只能是1:8 - 1:22之间？
A: 这个要根据不同生物分子性质确定，更准确的说与生物分子表面氨基个数有关系；最佳标记比例可根据梯度用量测试确定。
Q: 如果选择标记试剂盒中的超滤管型号?
A: 一般来说，您待标记生物分子的分子量是超滤管截留分子量的2倍以上最好；比如，标记抗体，抗体分子量为150Kd,选择分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超滤越慢。如果分子量太小，标记完以后建议用更高精度的纯化方式，比如，10kD分子量建议用HPLC纯化
Q:标记效率低
A:有以下原因：
1）缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris或氨基乙酸），标记前用PBS透析。
2）蛋白含量较低 (≤1 mg/mL)会影响标记效率。
3）标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率最高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至最适水平。要么加大重碳酸盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1 M碳酸氢钠透析等。
4）研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。
5）不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有最好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。
