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菌种鉴定
  • YMFX-031
  • 北京亿鸣复兴实验类技术服务
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  • 2022-11-30 17:45:52

北京亿鸣复兴生物科技有限公司

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★实验描述:
环境微生物多样性检测,是以样品中的微生物群落作为整体进行研究,通过对核糖体RNA高变区域(比如16S/18S/ITS等序列)或功能基因(如古菌的氨氧化基因等)进行PCR扩增和测序,然后分析相应环境下微生物群落的多样性和分布规律,对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源利用有着重要的理论和现实意义。
★服务内容:
16S rDNA:编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和可变区,保守区反映生物物种间的亲缘关系,可变区反映物种间的差异。
18S rDNA:编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和可变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系,可变区反映物种间的差异。
ITS1/ITS2:ITS1位于真核生物核糖体 rDNA序列18S和5.8S之间,ITS2位于真核生物核糖体 rDNA 序列5.8S和28S之间。ITS区域进化速率是18S rDNA的10倍之多。
服务流程:
扩增子测序实验流程:
 
扩增子测序信息分析流程:
★技术优势:
数据处理展示:
扩增子测序样品要求:
DNA样品:
1)原始DNA样本(PCR模板)合格条件为PCR产物中有明显特异16S条带;
2)50ulPCR体系对应产物总量至少100ng。
电泳图
DNA样品要求无蛋白质、无RNA及其他污染,无明显降解。
 
组织样品
1)粪便量在200mg以上(体积大概300ul,单次提取用量);
2)粪便中有异质固体或者含水量较高,样本量应在1g以上;
3)取样本后最好立即冻存在-80冰箱,-20度冰箱次之。
土壤样本
1)正常土壤单次提取量在500mg以上,建议至少送两次提取量;
2)土壤中有异质固体或者含水量较高,单次提取样本量应在1g以上;
3)取样本后最好冻存在-80/-20冰箱,防止样本内菌群差异化增殖导致比例变化。
样品采集注意事项:
采集的标本应盛于无菌容器内,确保所采集的标本无外源性的污染;
根据目的菌的种类(需氧菌、厌氧菌等)采用不同的方法采集标本;
所采集的标本必须有代表性,遵循单一变量原则(健康与非健康疾病的不同类型、自身特质等);
采集量不得过少,否则提取的DNA量过少不能满足后续实验;
对样本的来源、采集过程和方法等作详细记录。
样品采集及送样建议:
1.粪便样本
A.清晨采集动物的新鲜粪便样品于无菌离心管中;
B.样品带回实验室后分装至5ml或更大体积的EP管或冻存管中(新鲜粪便样品称取2q置于5ml EP中即满足单次提取),10份;
C.迅速置于-80℃中冷冻3~4小时,然后转移至-80℃中长期保存;
A.早晨采集动物新鲜粪便样品,迅速将粪便样本放于厌氧培养罐中,同时打开厌氧产气袋,将装有粪便样品的厌氧罐和尿样置于冰盒中,30分钟内运至实验室进行样品预处理;
B.样品前处理:称取粪便样本3克。30ml无菌PBS,漩涡2min充分振荡,200×g离心4min取上清干新的50ml无菌离心管中,沉淀重复操作三次;沉淀再次用30ml PBS洗涤,沉淀用10ml PBS重悬,分装于2ml离心管中,10份,干冰上速冻,转移至-80℃保存。
3.各种相关昆虫、动物及相关组织
A.挑取昆虫个体若干,用无菌水漂洗多次冲洗掉体表土壤颗粒,随后用75% 酒精清洗虫体体表并浸泡2min进行体表消毒,最后再用无菌水冲洗2次;
B.无菌条件下剪开虫体,取出肠道,将中肠内含物溶解于1mL无菌水中混匀放入无菌的2mL EP管中,10份,速冻,转移至-80℃保存;
C.运送方式:干冰运输。
4.水样(海洋、湖泊、鱼塘、自来水)
A.采用三点取样法取样,取湖水表层水,样品用经过灭菌的洁净的纯净水瓶进行采集,采样前用所采水样将其反复冲洗数遍;
B用采集回来的水样样品1L通过0.22um滤膜真空过滤,水样中的总微生物被富集在滤膜表面,然后将滤膜保存在5ml buffer(20 mM EDTA、400 mM氯化钠、0.75 M蔗糖、50 mM Tris-Hcl(pH9.0))中,-80℃保存;
C.运送方式:干冰运输。

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