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Real-titer慢病毒滴度测定(Q-PCR)试剂盒
  • GE-20006-100
  • 东岭生物
  • 上海市
  • 现货
  • 100test
  • 2970
  • 2022-08-24 11:38:08

上海乐赛生物科技有限公司

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本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定,计算出初始病毒的有效滴度。

产品特点
本产品采用感染病毒后靶细胞基因组作为模板,测得数据更真实

基于Taqman探针法开发本产品,结果更准确
适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定

产品成分

试剂名称

内容

数量

Solution 1

标准品DNA模板(5x10^9 c/μl)

100μl

Solution 2

Lenti-primer (10μM)

40μl

Solution 3

Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM)

80μl

Solution 4

Taq (probe qPCR) (2X)

1ml

Solution 5

ROXI(50X)

40μl

Solution 6

ROX II(50X)

80μl


其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂(离心柱法)
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖

操作步骤
  1.取感染72h后的293T细胞,胰酶消化制备单细胞悬液,细胞计数,得细胞数为N;
  2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA,测定基因组DNA总量为G (μg),稀释至50ng/μl备用;
注:此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒
  3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品:

 

标准品管

样品管

#

稀释倍数

Water

标准品

拷贝数/μl

稀释倍数

Water

样品(50ng/μl)

1

10^1

45μl

5μl

5.45x10^8

10

45μl

5μl
2

10^2

45μl

5μl of 1#

5.45x10^7

50

40μl

10μl of #1

3

10^3

45μl

5μl of 2#

5.45x10^6

100 45

5μl of #1

4

10^4

45μl

5μl of 3#

5.45x10^5

 
5

10^5

45μl

5μl of 4#

5.45x10^4

6

10^6

45μl

5μl of 5#

5.45x10^3

  梯度稀释取样前,需充分混匀;
  4.根据下表配制反应液,每组配制3个复孔:

试剂

用量

终浓度

标准品或样本

2μl

*1

Lenti-primer (10μM)

0.4μl

0.2μM

Lenti-probe (2.5μM)

0.8μl

0.1μM

Taq (probe qPCR) (2X)

10μl

1X

ROX

*2

 

Water

补至20μl

 

  *1:样本除步骤3中稀释的3种浓度外,另需一组未稀释样本,即总量为100ng/孔;另需设置阴性对照孔,即不添加任何DNA模板;
  *2:根据所使用仪器添加:

 

适用仪器

ROX I (终浓度1X)

7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System

ROX II (终浓度0.5X)

7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System

无需ROX

Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System

  5.上机,按照以下程序进行Q-PCR反应:
    变性 (1 Cycle):95℃ 30s
    扩增 (40 cycles):95℃ 5s + 60℃ 30s   
注:可根据具体使用仪器自行调整程序。
  6.计算标准曲线:计算每组标准品的平均Ct值,以平均Ct值为X,Loge(copy number)为Y,生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99;
  7.计算样本平均Ct值,带入标准曲线计算出copy number=n。
注:以Ct值在标准曲线范围内的数据为准,若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值,需对样本稀释倍数进行相应调整。
  8.计算病毒滴度:举例
    Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
    其中:n=步骤7中计算所得拷贝数;d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100);G=基因组提取所得DNA总量(μg);N=基因组提取所用细胞数;Nori=病毒感染时细胞数;V=病毒感染时病毒用量(ml)。
    计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度,取平均值为最终结果。

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