检测原理：双色荧光探针分别检测端粒酶催化亚基TERT基因mRNA和内参基因GAPDH mRNA。在进行样本检测时，

同时检测阳性细胞293T和阴性MRC-5细胞做为对照，利用∆∆CT法计算样本中TERT基因的相对表达量。

 

检测所用试剂及仪器

1. 检测所用试剂

RNA抽提试剂盒：FineProtect通用型RNA提取试剂盒(Code No.203，济凡生物科技(常州)有限公司，中国)

RNA逆转录试剂盒： RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(00820611，Thermo scientific，Germany)

双色荧光TERT基因检测试剂盒：上海翼和应用生物技术有限公司自研

阳性对照：293T细胞

阴性对照：MRC-5细胞（正常的人胚肺细胞） 

2. 检测所用主要仪器

荧光定量PCR： Real Time PCR System(SLAN-96S，中国)

RNA质控：Nanodrop 2000C Spectrophotometer(Thermo scientific，Germany）

实验目的及步骤

1. 实验目的

      利用多重TaqMan探针的方法，以端粒酶活性阳性293T细胞和阴性MRC-5细胞做对照，检测样本端粒酶催化亚

基TERT基因表达量。

2. 逆转录反应

1).DNase Ⅰ处理

 

                                   反应程序：37℃ 30min；加EDTA 1 µL 后，65℃，10min

2).逆转录反应

 

                                   反应程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min

 

 

 

3.qPCR（20ul体系）

   

反应程序：94℃ 5min （95℃ 15s ，58℃ 45s ，72℃ 1min）*40

判读标准

1. 阳性对照4倍稀释后TERT基因Ct值在25±3，内参基因Ct值在17±3，8倍稀释后TERT基因Ct值在26±3，内参基因Ct值在18±3，对照品

端粒酶活性为阳性，显示实验稳定检出阳性样本的TERT基因表达量。

2. 阴性对照经4倍、8倍梯度稀释后，TERT基因Ct值≥35（或检测不到），内参基因Ct值仍在18±3之间，阴性对照品端粒酶活性为阴性。

定量PCR扩增曲线

                左:阳性细胞293T的扩增曲线,右: 阴性细胞MRC-5的扩增曲线

（蓝色为TERT曲线，红色为内参GAPDH曲线）