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RC200130	人肺类器官分化试剂盒	19860

 

 

产品信息

产品名称：人肺类器官分化试剂盒

货号：RC200130

批号：见包装

试剂清单：

序号	名称	数量	货号	存储
1	S1完全培养基	50 ml ×1	RC200130-1	-20至-80   ℃
2	S2完全培养基	100 ml ×2	RC200130-2	-20至-80 ℃
3	S3完全培养基	100 ml ×3	RC200130-3	-20至-80   ℃
4	基础培养基	100 ml ×1	RC200130-4	2-8   ℃

存储与有效期：

组分1、2、3于-20至-80 ℃避光保存，组分4于2-8 ℃避光保存。组分1、2、3必须避免反复冻融；首次完全解冻后可以按使用量进行分装，置于-20至-80 ℃长期保存；2-8 ℃条件下，稳定储存2周。

适用范围：

本试剂盒适用于人定型内胚层细胞（SOX17⁺/FOXA2⁺细胞，详见本公司定型内胚层高效分化试剂盒，RC200123）进一步定向肺系细胞分化，同时进行立体培养，形成肺类器官。

产品介绍

类器官与悬浮培养是当前再生医学研究与应用的前沿，是未来再生医学与组织工程发展的趋势。为适应日益发展的科研需求，并为生命科学尤其是再生医学研究的需要，开发优化了相关产品，可以为科研工作者提供稳定的研究平台，以助力研究的时效性和经济性。该产品设计同时考虑再生医学临床前研究的需求，可以为研究人员提供大量稳定的种子细胞，加速应用后期技术的研发。

本产品无血清、成分明确、含有细胞保护因子，适合于人多能干细胞分化为定型内胚层细胞之后进一步肺类器官的诱导。

操作方法

实验准备

u 完全培养基准备：

组分1-3（S1、S2、S3）均为完全培养基：2-8℃解冻。完全融化后轻轻摇匀，可以按照实际使用量分装。分装后立即存储于-20至-80 ℃，避免反复冻融。

注意：2-8℃冰箱过夜，切不可置于37℃水浴剧烈解冻，解冻后请务必充分混匀，以保证培养基成分的均匀度。

u 自备试剂耗材：

l  多能干细胞完全培养基

l  定型内胚层高效分化试剂盒（RC200123）

l  基质胶

l  贴壁细胞培养板

l  细胞固定液（2-4%中性多聚甲醛）

操作方法

1.   S1阶段：人多能干细胞提前分化为定型内胚层细胞 （建议分化效率大于80%，流式细胞术检测SOX17⁺/FOXA2⁺细胞），弃去培养基，用适量基础培养基（RC200130-4），培养基加入量约2 ml/孔（六孔板），轻柔洗2次。弃去培养基，轻柔加入S1完全培养基，培养基加入量约2 ml/孔（六孔板），每天换液，连续5天。

注意：该试剂盒从定型内胚层细胞起始，定型内胚层细胞诱导方法见定型内胚层高效分化试剂盒，RC200123。定型内胚层细胞状态对肺类器官诱导成败十分关键，需特别注意。

注意：以上操作方案以六孔板为例，若使用其他器皿可以根据需要自行调整方案。调整方案时建议以细胞密度为稳定因素。细胞培养箱条件为37℃、5% CO₂、饱和湿度。所有培养基在使用前必须进行室温复温。这些注意事项同样适用于以下步骤。

2.       S2阶段：S1阶段5天诱导结束后，提前准备好立体培养用基质胶（推荐BD Biosciences公司，货号356237，以下简称3D胶）。S1细胞用DMEM/F12培养基洗2次，加入适量的消化液（RegenTASE，RC200111或ACCUTASE；6孔板每孔700 μl左右，消化液覆盖细胞即可），置于37℃培养箱中消化3-6 分钟。每2分钟置于倒置显微镜下观察，待克隆边缘发亮时即轻柔吸弃消化液。加入适量的S2完全培养基轻柔吹打细胞数次，将细胞悬液移至1.5 ml EP管中，200-300 g离心5分钟。弃上清（20 μl枪头进一步吸弃上清，过多上清残留会影响立体培养），轻轻振荡使细胞团块散开，置于冰上2-3分钟。取100 μl提前准备好的3D胶（冰上）加入细胞，轻柔吹打，使细胞分布均匀，切勿产生大量气泡。按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推荐每孔滴6滴左右，置于37℃培养箱中20分钟左右使3D胶固化，固化后加入3-5 ml的S2完全培养基，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。每2天换液一次，每4-6天传代一次。S2阶段共12天。

注意：试剂准备，BD Biosciences公司货号356237的3D胶使用方法，须将3D胶置于冰上融化，分装后保存于-80℃，避免反复冻融。使用时，提前按置于冰上过夜融化备用。

注意：为了降低消化过程对细胞状态的影响，建议在消化液中加入10 μM的 Y-27632。

注意：移液枪吹打细胞时务必轻柔，切不可产生大量气泡，本试剂盒全程均需注意此问题。

3D传代方法：用无菌巴氏吸管将立体培养的类器官（含3D胶）刮下并转移至1.5 ml EP管中，用1 ml枪头机械吹散胶体， 200-300 g离心5分钟。弃上清（20 μl小枪头进一步吸弃上清，过多上清残留会影响立体培养），置于冰上2-3分钟。取100-200 μl左右提前准备好的3D胶（冰上）加入细胞，并轻柔吹打，使细胞分布均匀，按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推荐每孔滴6滴左右，置于37℃培养箱中20分钟左右，使3D胶固化，固化后加入3-5 ml S2完全培养基，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

注意： 传代比例1：2到1：4，根据类器官生长情况具体判断。

3.       S3阶段：S2阶段诱导12天后，3D培养物用基础培养基轻柔洗2次，加入适量S3完全培养基，S3阶段3D传代同S2阶段，S3阶段共20天，形成立体的含肺谱系多种类型细胞的肺类器官。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板，也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；细胞的初始状态对分化的成功至关重要，请务必保证初始细胞的可靠性。该试剂盒仅用于定型内胚层细胞向肺类器官分化的研究，用于其他研究时该操作规程仅作为参考。