3.2平衡

使用2~5倍柱床体积的上样平衡液平衡柱子，务必使流出液的电导和pH同上样缓冲液的电导和pH完全一致。平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris、PBS等。 

3.3上样

（1）样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。盐浓度太大的样品处理后再配。

（2）一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

（3）介质对样品组分吸附的程度取决于样品的带电性质、流动相的离子强度和pH值。盐浓度小，介质对样品组分吸附较牢。用 CM层析介质时，推荐的pH值是大于目标产品等电点1个单位。

3.4洗脱

可用增大盐浓度或增大pH值进行洗脱，常用增大盐浓度的办法洗脱。

3.5再生

一般先用高盐浓度的缓冲液（含1~2mol/L NaCl）洗或减小pH洗10倍以上柱体积，然后用结合蛋白时的平衡液洗到平衡即可。

若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

3.6在位清洗

（1）对于以离子键结合上去的蛋白，可用0.5~1倍柱床体积的2M NaCl去除。

（2）对于沉淀蛋白、疏水性结合的蛋白或脂类，可以先用1倍柱床体积的0.1M NaOH冲洗，再用平衡缓冲溶液清洗直至pH呈中性。

（3）对强疏水性结合的蛋白、脂类等，用4~10倍柱床体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，需注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。

3.7存储

密封保存在4~30℃（保存溶液为20%乙醇）干燥、通风、清洁处，不可冷冻；用过的柱子保存在4~8℃，20%乙醇溶液中。

3.8运输

运输中避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。

4.注意事项

（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就可以获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低；柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。 

（2）纯化过程必须严格控制洗脱缓冲液的pH及离子强度。样品与 CM层析介质必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。 

（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

（4）洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。

（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。

（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

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