拨开迷雾：关于荧光定量的内参基因选择，可能还有这些你不知道的

大家都知道，内参基因的作用就是去除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，从而获得目的基因特异性表达的真正差异。所以，我们会选择内参基因进行校正和标准化。通常我们选择内参基因的标准是①高度或中度表达，排除太高或者太低；②表达水平不受任何外源性因素等影响；③不存在假基因。
 

今天我们来扒一扒上述三个内参基因。

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写，经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中，并且在细胞中含量丰富，占总蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同种细胞或者组织中的蛋白表达量一般是恒定的。故长期以来该基因被广泛用作qPCR或Western blot中的内参基因。

GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，正是因为如此，在代谢中过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量ATP增多，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，GAPDH作为内参应慎重。

GAPDH基因功能的多样性

β-actin选作内参基因因其序列高度保守，其mRNA表达数量高，是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。该基因几乎在所有真核细胞中表达，广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。故作为内参基因是得到公认的。

对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，存在于组织分布特异性，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mRNA的表达水平增加；而假基因的的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。

18S rRNA与30多种核糖体蛋白共同构成真核生物核糖体40S小亚基，从而与60S大亚基一起完成细胞中的蛋白质合成。

18S rRNA作为内参的原因可总结如下：①18S rRNA存在于核糖体小亚基中，其编码基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化过程中相当保守；②存在于所有真核生物细胞中； ③易于使用通用引物扩增；④rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成，mRNA是由RNA聚合酶II合成，因此rRNA合成的调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种rRNA水平很少发生变化；⑤rRNA属于高峰度表达，远远高于目标mRNA，较其他内参基因稳定且受RNA降解影响较小。故18S rRNA被广泛选作内参。

同样是rRNA的5S rRNA和5.8S rRNA以及28S rRNA就不适合作为内参，因为①5S与5.8S在核糖体大亚基中的rRNA分子序列短，提供的信息少；②28S rRNA序列虽然较长，可提供更多的信息，能更准确地揭示系统发育的规律，但基因数据库中相关信息较少，不利于比较分析。

然而，rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18S rRNA明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rRNA没有poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录，建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外，还要用18S作为反向引物，反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下，再高温灭活。

其他内参基因的表达情况

其实不仅仅是GAPDH和β-actin或18S rRNA这三个基因在作为内参基因的存在问题，其他的很多内参基因在不同组织中的表达水平也是存在较大差异的。如不同内参基因在不同组织中表达波动较大的HPRT基因△CT为10.3；同一内参基因在不同的组织中，如心，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾等组织中表达也不是恒定的。见下图：

没有一种RNA的表达水平在所有条件下是恒定的，在各种因素的影响下，如细胞周期的不同阶段，内参基因的RNA表达水平是变化的。至今，不存在任何一种基因适用于所有类型的细胞或组织。故我们研究者应该根据自己所研究的细胞和组织类型以及实验要求，做预实验。从多种内参基因中筛选出适合自己实验的稳定表达的内参基因。同时也可以选择多内参基因的研究方法，设置两个或两个以上内参基因，取平均值，然后去校正自己的目的基因能够得到更可靠的结果。

（1）Radonić A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2004, 313(4):856.

（2）Mazurek S, Grimm H, Boschek C B, et al. Pyruvate kinase type M2: a crossroad in the tumor metabolome.[J]. British Journal of Nutrition, 2002, 87 Suppl 1(S1):S23.

（3）Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al. Reference gene selection for RT-qPCRnormalization in potato during biotic and abiotic stress[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421):2907-2914.