手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列：cDNA的这2个要素，你注意到了吗？

为什么逆转录后的cDNA不需要用Nanodrop来检测浓度与纯度呢？因为逆转录后的产物是一个混合体系（含有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分），会干扰cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在这个位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分别相当于50 ng/μL的双链DNA，37 ng/μL的单链DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。例如，就dNTP而言，即使cDNA浓度一样，但dNTP也会严重干扰其测定结果。

为此，我们专门进行了验证，以进一步说明dNTP 投入量对cDNA浓度检测结果存在的影响。以小鼠肌肉组织RNA为模板，采用Yeasen逆转录试剂盒11121ES（dNTP 组分按 1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度检测）、T品牌、V品牌试剂分别进行逆转录实验，RNA 投入量为500 ng，逆转录体系及程序分别按各自说明书进行。采用Nanodrop测定cDNA浓度，并取相同体积cDNA分别进行qPCR实验，结果证明：

表1. Nanodrop定量结果统计表

图1.qPCR检测结果△Ct＜1，且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系

gDNA的污染主要来源于RNA模板， 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA残留呢？可以在逆转录之前将RNA模板进行琼脂糖凝胶电泳验证。如下图所示，泳道上部有明显的高分子杂带，则可能有gDNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验的准确性造成影响。
 

 图2. 高质量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）

如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA，可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组（以未逆转录的RNA作为模板）验证，如下图所示，NRC具有明显的扩增，表明RNA中可能含有gDNA污染。

 图3. qPCR扩增曲线图。NRC：阴性对照组

[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）

[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493) 

[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）

[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）

[5] Xu L ,  Xu S ,  Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)

以上是小翌本期给大家分享的内容，主要介绍了逆转录得到的cDNA浓度和纯度是否需要用Nanodrop仪测定和如何判断cDNA是否存在gDNA污染这两个问题。下期，我们将给大家介绍qPCR的背景与原理，我们下期不见不散哦~