U251MG/TMZ 人类星形胶质瘤耐替莫唑胺细胞

一、细胞简介：

　　通过外植技术衍生自恶性胶质母细胞瘤肿瘤。

　　细胞特性

　　1）来源：U251胶质瘤耐药筛选

　　2）形态：贴壁细胞

　　3）含量：>1×106细胞数

　　4）用途：仅供科研使用。

　　二、细胞耐药诱导过程

　　待细胞生长稳定后，开始倍增药物诱导剂量，每个剂量保持至细胞可以稳定生长至汇合度达50%以上。递增药物浓度依次为：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。约8个月后，细胞可在16μg/mLTMZ药物浓度下稳定生长，视为耐药细胞株构建成功，并命名为U251MG/TMZ。

　　三、细胞的培养：

　　细胞培养试剂的配制

　　1）TMZ药物的配制及保存

　　建议将TMZ药物配制成16mg/mL的母液：即使用1mLDMSO溶液溶解16mgTMZ药物，使其溶解。

　　注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

　　2）冻存液的配制

　　90%胎牛血清+10%DMSO，现用现配。

　　3）培养基的配制

　　细胞培养条件

　　气相：空气，95%；二氧化碳，5%；温度：37℃，培养箱湿度为70%~80%。

　　细胞处理

　　1）冻存细胞的复苏

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4~6mL培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3~5min，弃去上清液。加入1mL培养基重悬细胞后，均匀铺于含6~8mL培养基的培养瓶（或皿）中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。

　　注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞贴壁，形态展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度；

　　②建议复苏细胞时始终穿戴防护手套和面罩，避免冻存管因温差较大而发生爆炸，造成人员伤害。

　　2）细胞传代（建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代）

　　①待细胞密度达到80%~90%时，即可进行传代培养。

　　②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。

　　③加入适当体积的0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶-1mL，其它培养器皿可覆盖培养底面即可），置于37℃培养箱中消化2~5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶使细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。

　　④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。

　　⑤向细胞沉淀中加入1~2mL培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6~8mL培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。

　　注意：细胞传代过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞贴壁，形态展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度。

　　3）细胞冻存

　　①细胞冻存时，步骤同2）细胞传代的①~④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×106~1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。


　　四、细胞运输、保存及注意事项