模式动物之常见问题

1. 常见大小鼠品系？

答：大鼠品系主要有：SD、Wistar、Lewis、Long-evens；小鼠品系主要有：C57BL/6、BALB/C、BALB/C-nu/nu、FVB、DBA/1、DBA/2 及 129 等。

2.在生物学研究中大鼠模型相比小鼠模型的优点与缺点？

答：大鼠的特点是：体型适中，性情温顺，采血量大及生育能力强。小鼠特点：体型小，生长期短，成熟期早，性情温顺、繁殖力强及易操控等。大鼠相比小鼠主要的优势在于：一只大鼠通常可以提供足够的一般实验分析需要的血液和体液，易于实验操作。而小鼠的血液量则不够。小鼠由于其体小、饲养方便、易于控制、繁殖快等特点，因此应用更加广泛。

3.免疫缺陷动物及应用范围？

答：免疫缺陷动物:指由于先天性遗传缺陷或用人工方法造成一种或多种免疫系统系缺陷的动物。主要分为获得性免疫缺陷动物:又叫诱发性免疫缺陷动物，指采用人工方法干预造成其免疫功能缺陷或低下的动物。遗传性免疫缺陷动物：又叫自发性免疫缺陷动物，指动物自发性的免疫缺陷疾病或由于基因突变的异常表现，通过定向培育而获得的免疫功能缺陷或低下的动物。主要应用范围：肿瘤学研究（肿瘤发展机理和抗肿瘤药物筛选等）、免疫系统研究、感染性疾病、肝脏研究及自身免疫性疾病等。

4.转基因动物的小鼠品系如何选择？

答：根据不同的研究方向和目的，选择小鼠品系也有不同，主要是根据不同品系的基因表达情况来选择， 如C57BL/6小鼠：该品系小鼠模型目前广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究，并已成为发表文章的首选小鼠品系。FVB 小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比较单一，具有易于原核注射的优点。

基因编辑动物常见问题

1. 什么是基因编辑动物及应用？

答：利用基因编辑的手段改变动物的目的基因片段，包括基因删除、插入或调控基因的方式等，最终达到改变动物基因型的目的。基因编辑动物应用：基因功能基础研究，疾病机理研究，药物筛选及药物毒理学研究等。

2. 基因编辑动物分为哪几类？

答：基因编辑动物主要分为基因敲除、基因敲入、大片段缺失及基因修饰等。

3. 利用 CRISPR/Cas9 基因编辑动物构建的基本流程？

答：

① 针对特定基因序列，利用软件（sgRNA Designer）预测潜在 sgRNA 序列，并依据实验要求挑选合适的靶点；

② sgRNA 活性筛选，选出有活性且特异性高的 sgRNA；

③ 构建 sgRNA 表达载体，并利用 T7 体外转录试剂盒进行 sgRNA 体外转录；

④ 利用 SP6 转录试剂盒进行 Cas9 mRNA 体外转录；

⑤ 将 Cas9 mRNA 和 sgRNA 按合适浓度混匀，并进行受精卵显微注射；

⑥ 注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内继续发育；

⑦ 待子代小鼠出生后对其进行基因型分析。

4. CRISPR/Cas9 条件性敲除的构建？

答：设计两条 sgRNA 及带有 Loxp 位点的同源重组模板，利用 CRISPR/Cas9 介导的同源重组，在靶基因特定外显子两侧的内含子中各敲入一段方向相同的 LoxP 序列，在 Cre 重组酶的作用下，两个 LoxP 位点间的靶基因被切除，起到条件敲除靶基因的作用。

CRISPR/Cas9 系统常见问题

1. CRISPR/Cas9 是怎么发现的？

答：CRISPR 系统是古细菌和细菌的一种不断进化适应的免疫防御机制，早在 1987 年发现大肠杆菌里有串联间隔重复序列，直到 2002 年被命名为 CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats）。2012年 CRISPR/Cas9 的详细作用机制被发现，并预测可作为基因编辑技术。2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。从此，该技术迅速被运用到基因敲除大小鼠动物模型的构建之中。

2. CRISPR/Cas9 基本原理是什么？

答：由成簇的规律性间隔的短回文重复序列 CRISPR 和核酸内切酶 Cas9 组成。crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA （single guide RNA ），引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

3. CRISPR/Cas9 的应用？

答：CRISPR 的应用主要包括：构建基因编辑的模式动物、基因治疗及遗传育种等。

4. ES 打靶技术原理及其优劣势？

答：基因打靶是建立在 ES 细胞与 DNA 同源重组上的技术，是构建基因编辑鼠的传统手段。通过同源重组将外基因定点整合入靶细胞上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的一项技术。基因打靶技术广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的构建以及遗传物种的改良等方面。缺点在于：周期长且构建打靶载体比较困难；花费大量人力和物力；成功率较低。