Topo克隆系列专题

Topo克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。不同于传统的TA克隆，Topo克隆技术能够在2-5 min内快速完成插入片段和载体的连接反应，操作简单，连接效率极高，克隆阳性率接近100%。

传统的TA克隆对于PCR产物的要求较高，而且连接反应时间很长，同时阳性率低，而且自连率很高，无形中会成倍地增加科研者宝贵的时间。翌圣生物推出Hieff Clone® TOPO系列克隆载体，能够快速而且高效地得到目的重组载体。Hieff Clone® Zero TOPO载体为零背景载体，载体骨架中含有自杀ccdB基因。此克隆方法无需蓝白斑筛选，阳性率100%。

Hieff Clone® Zero TOPO Simple系列载体，使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。

快速：仅需2-5 min即可完成连接反应

高效：无自连现象，阳性克隆率100%

简便：只需加入目的片段即可

高效克隆1-5 kb基因

图1：Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5 kb基因，成功率100%。A-C：TOPO克隆转化平板。D-F：插入片段PCR鉴定电泳图。

图2：相同体系下，克隆3 kb目的基因，Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit较同类产品具有高连接效率。

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»  Q1：从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗？为什么？

A：Topo载体进行连接反应的时候需要5'羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5'羟基端没有磷酸化，可以直接进行TOPO克隆。但是，酶切产物5'端为磷酸化状态，可以直接进行TA克隆的，但是不能进行Topo克隆。如果需要，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）进行去磷酸化处理后连接Topo载体。

»  Q2：连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗？

A：建议反应体系应控制在10 μL内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般1-2 min即可完成连接反应，若想得到更多克隆，可适当延长至 5min，但不能超过5 min。室温反应即可。

»  Q3：如何选择合适的载体？

A：若PCR产物为Taq酶扩增则选择TOPO-TA克隆载体系列，若PCR产物为高保真酶扩增则选择Blunt载体系列。Simple载体不含多克隆位点区，可根据客户需求在PCR扩增时添加自己需要的酶切位点。

»  Q4：若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗？

A：建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些，若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。

»  Q5：PCR扩增产物需要纯化吗？

A：先对PCR产物跑胶鉴定，若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。