ECL发光解决方案

增强ECL化学发光法

ECL显色原理：发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物,过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP。HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活，是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶，在室温放置时间过长会导致降解。同时在发光过程中有其他物质(比如显影液)污染了膜的话，也有可能灭活膜上的HRP。

试验步骤:

• 将两种显色底物1:1等体积混合(一般各1ml/membrane)。
• 将混合物覆盖在膜表面，1-2min，摇晃使均匀。
• 用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
• 在暗室中将X光片盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
• 5)显影、定影。

6)根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意:荧光在一段时间后会越来越弱。

现状分析：

目前市场上普通的ECL实际在使用过程中经常出现易淬灭、高背景、不稳定以及低丰度蛋白难以检测等问题，影响最终的实验结果。

下图为普美克产品和 TXXXXo 公司 SuperSignalWest Dura 的检测效果对比图。Western 检测过

程中仅发光试剂不同，其余完全相同。图中可见，TXXXXo 公司的 West Dura 的检测灵敏度大约为普美克产品的50%左右。

解决方案：

推荐使用武汉普美克研发生产的Super ECL，特超敏 ECL 发光底物检测试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶 HRP 的抗体及其关联的抗原，是一种可广泛应用于免疫学实验的化学发光试剂。由于采用了独特的发光底物系统和高灵敏度荧光 ECL 发光试剂，特超敏 ECL 发光底物检测试剂盒是目前最灵敏的商业化荧光 ECL 检测试剂之一，灵敏度高于常规超敏ECL 检测试剂数十倍乃至数百倍：

(1) 具有极高灵敏度和高信噪比，可检测 10～100fg 微量抗原；

(2) 发光迅速且稳定，荧光可使 X 光胶片感光达 12 小时以上，特别适用于痕量蛋白或核酸检测；

(3) 可使用更高的抗体稀释倍数(1:5000～1:20000)，极其节省抗体。

(4)优异的性价比，更高的性能，更低的价格。

使用方法：

(1) 使用合适的方法进行 Western Blot，直至用 PBST 洗涤二抗。注意用 HRP 标记 IgG 或用一抗-链亲和素-生物素-HRP 夹心法。

(2) Western Blot 最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液 A 和 B，放入干净容器中混合备用。工作液宜在临检测前配制，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

(3) 用 WB 专用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜置于一洁净保鲜膜上，然后使其完全浸入新配制的发光工作液(0.1mL 发光工作液/cm2膜)中充分接触，室温孵育 2 分钟。孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显的灵敏度降低，为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。

(4) 用 WB 专用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液，但勿洗去发光液。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。

(5) 压片检测：将 Western Blot 膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹 Western Blot 膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。将覆盖 Western Blot 膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。打开 X 光胶片暗盒，暗房内压 X 光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟，然后定影显影冲洗。最后根据结果再调整压片时间得到满意的压片结果。

(6) 化学发光成像仪检测：将膜放置到化学发光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

注意事项：

(1)各溶液使用完后，请盖紧瓶盖以防失效。特别是 B 液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。

(2) A 液和 B 液在吸取过程中必须要更换枪头，A 液和 B 液相互污染后会导致 A 液和 B 液逐渐失效，影响后续的使用效果。

(3) 步骤 1～4 可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。

(4) 长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系；曝光不足则条带模糊。

(5) 发光工作液孵育约 2 分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使 X 光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间，肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使 X 光胶片感光，因而弱带可曝光 1-10 小时。

(6) 由于特超敏发光液极其灵敏，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗 1:2000～1:10000，二抗 1:5000～1:20000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带导致失败。

(7) 当发现特超敏 ECL 发光底物检测试剂盒(PMK003)的检测灵敏度过高而影响检测结果时，可以选择检测灵敏度较低一些的超敏 ECL 发光底物检测试剂盒(PMK0448)，或者减少样品、一抗或二抗的用量。

(8) 某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。尽量使用 WB 专用镊子或者塑料镊子，金属镊子可能会造成淬灭荧光。

(9) NaN3能抑制 HRP 活性，因此缓冲液中应避免使用 NaN3做为防腐剂，如必需使用勿超过 0.01%。

(10) 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

(11) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，且戴手套可以避免在印记膜上留下手印。