RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞的处理方法与应用！

一、背景

RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞分离自小鼠源前列腺癌的上皮细胞样贴壁细胞，主要用于RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞的体外研究。RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。培养条件：DMEM+10%FBS，37℃，5% CO2，冻存条件：90%FBS+10%DMSO。

二、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。

1.尽量吸干净T25瓶原培养基；

2.加3-4ml 常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；

3.T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层；

4.将培养瓶放入37度培养箱消化；

5.消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化；

6.混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

7.加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里；

8.补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养；

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于B7-H3调节髓源性抑制细胞凋亡促进小鼠前列腺癌进展的实验研究：

利用自行构建的B7-H3高表达的小鼠前列腺癌RM-1（RM-1-B7-H3）及对照细胞株（RM-1-mock），通过体内、体外实验分析B7-H3在小鼠前列腺癌进展中的免疫作用机制。

方法：检索小鼠B7H3的核苷酸序列，合成小鼠B7H3基因片段，转入目的载体，利用Gateway Technology构建B7H3基因高表达的质粒载体，脂质体转染获得稳定RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock为对照细胞。

应用荧光显微镜下观察转染绿色荧光蛋白表达、RT-PCR检测mRNA表达的变化以及流式细胞仪技术检测分析，鉴定RM-1-B7-H3转基因细胞的效率及稳定性。

在此基础上，体外实验比较分析RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock细胞增值能力；自C57BL/6小鼠皮下接种RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock细胞，观察体内成瘤情况；分离不同实验组荷瘤小鼠肿瘤组织及脾脏组织，流式分析技术检测各组间Gr-1+CD11b+MDSC表达水平，并以PI评估MDSC凋亡情况；离体实验中，自健康C57BL/6小鼠脾脏分离纯化Gr-1+CD11b+MDSC，并分别与RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock细胞混合培养，以PI表达情况分析B7-H3对MDSC凋亡的影响；为进一步确认B7-H3对MDSC的凋亡作用。

同时采用siRNA技术干预髓源性细胞株THP-1上B7-H3表达构建THP-1B7-H3low细胞以及THP-1-NC组，体外实验分析B7-H3缺失对髓源性细胞凋亡的影响。此外，还在利用环磷酰胺抑制C57BL/6骨髓增殖的基础上，再次皮下移植接种RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock细胞，观察肿瘤生长情况，分析B7-H3发挥促瘤作用是否依赖于髓源性细胞。

结果：成功构建稳定表达、高效表达B7-H3的RM-1转基因细胞。体外实验RM-1-B7-H3转基因细胞以及RM-1-mock细胞在增殖能力方面两者并无统计学差异；然而，体内实验发现RM-1-B7-H3转基因细胞肿瘤生长显著高于RM-1-mock细胞。

进一步研究发现，荷瘤RM-1-B7-H3的C57BL/6小鼠肿瘤组织及脾脏组织中Gr-1+CD11b+MDSC细胞数量显著高于RM-1-mock荷瘤小鼠；同时，本论文还发现RM-1-B7-H3荷瘤小鼠体内MDSC凋亡率显著低于RM-1-mock荷瘤小鼠。

体外实验也证实RM-1-B7-H3细胞株与RM-1-mock细胞株相比，脾脏Gr-1+CD11b+MDSC凋亡率显著下降；人髓源性细胞株THP-1-B7-H3low体外凋亡水平显著高于THP-1-B7-H3high；上述结果提示B7-H3在抑制MDSC凋亡中发挥了重要作用。