m6A修饰在脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的具体作用尚不清楚。2022年5月25日，云序客户上海交通大学医学院附属仁济医院俞卫锋课题组在Front Immunol杂志上发表文章“METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modifification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome”该文章发现METTL3是参与m6A RNA修饰缺失的主要调控因子，能通过trim59相关的NF-kB失活抑制脓毒症诱导的ARDS的内皮损伤。云序生物有幸参与了此项研究中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq等高通量技术服务。

发表期刊：Front Immunol
发表日期：2022年5月25日
影响因子：8.786
研究方法：RNA-seq、m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、ELISA比色法
样品类型：细胞
文章链接：METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome

 

 

01  脓毒症诱导的ARDS中m6A修饰的失调
为了阐明m6A修饰在隔膜诱导的ARDS中的功能作用，文章首先通过ELISA比色法评估了健康小鼠肺组织和脓毒症小鼠肺组织中的RNA m6A整体水平，发现脓毒症肺中总RNA中的m6A水平显著降低（图1. A）。比较肺组织和肺微血管内皮细胞（PMVECs）中writers(METTL3、METTL8、METTL14和WTAP)和erasers(ALKBH5和FTO)的mRNA m6A水平，发现甲基转移酶METTL3和METTL14在脓毒症肺和LPS刺激的PMVECs中显著下调，其他基因的表达无显著差异（图1. B-C）。通过免疫印迹法检测，METTL3在脓毒性肺组织和LPS处理的PMVECs中的蛋白表达也显著低于正常肺组织（图1. D-E）。免疫组织化学法结果表明，与正常肺组织相比，脓毒症肺组织中METTL3的表达明显降低（图1. F）。表明脓毒症的发生可能与m6A甲基转移酶METTL3的失调有关。

02  METTL3与脓毒症诱导ARDS中异常m6A修饰相关
为了确定METTL3在脓毒症诱导的ARDS中的作用，文章构建了METTL3敲低模型，研究了METTL3对脓毒症诱导的肺损伤的影响。假手术组小鼠的组织学检查显示肺正常，肺泡壁薄，偶有肺泡巨噬细胞，中性粒细胞少。METTL3 siRNA-CLP中的小鼠与NC siRNA-CLP组相比，该组的中性粒细胞浸润、出血、透明膜形成和肺泡壁增厚明显增加（图2. A），结果与肺损伤评分结果一致，并表明METTL3缺失显著加重了脓毒症诱导的肺损伤（图2. B）。与NC siRNA相比，METTL3 siRNA治疗后支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞计数、蛋白和促炎细胞因子表达水平显著升高（图2. C-D）。文章还检测了MPO的活性来评估肺组织中中性粒细胞的积累，METTL3下调显著提高了脓毒症小鼠的MPO活性(图2. E)。通过Evans blue组织分散度评估，METTL3基因敲除的小鼠显示血管渗漏增加(图2. F)，此外，对循环血液中测量了一组炎症标志物，结果表明，在检测的40种炎症标志物中，有12种比NC siRNA-CLP组中增加了至少2倍(图2. G)。siMETTL3处理导致CLP诱导的动物死亡显著增加，小鼠在72小时后没有存活(图2. H)。这些数据表明，METTL3的敲低加重了内皮屏障完整性的损伤和脓毒症引起的炎症反应。

03  METTL3在体外调节血管内皮屏障功能
由于METTL3在脓毒症肺中的表达显著下调，文章进一步研究了METTL3在内皮屏障维持中的关键作用。在不同的时间点用LPS刺激细胞。测量经上皮电阻(TEER)来评估屏障功能。METTL3的下调在6h时导致了单层抗性的显著降低，并持续了至少24h(图3. A)，表明METTL3的下调显著增加了HULEC-5a细胞的通透性。此外，文章还发现用METTL3 shRNA处理HULEC-5a细胞时，血管钙粘蛋白发生连接丢失和细胞间黏附分子-1积累(图3. C)，表明抑制METTL3会破坏内皮细胞通透性，加重内皮屏障功能障碍。与shRNA对照组相比，METTL3下调导致的炎症因子表达升高（图3. E）。而METTL3过表达能显著改善内皮细胞的单层抗性(图3. B)，并提高了ve-钙粘蛋白连接的表达（图3. D），炎症反应被有效抑制（图3. F）。结果表明，METTL3在血管间隔诱导的肺损伤中调节血管内皮屏障功能中起着关键作用。

04  METTL3介导的m6A的Trim59 mRNA修饰维持其YTHDF1依赖的稳定性
为了确定METTL3调控内皮屏障功能的分子机制，文章对两组HULEC-5a细胞进行了RNA-seq和m6A MeRIP-seq检测。m6A MeRIP-seq结果显示，1011个转录本中的m6A峰丰度下降（图4. A）。通过RNA-seq、m6A MeRIP-seq结果和GO分析，文章选择了5个与免疫应答调节和细胞粘附相关的5个基因(Tanc2、Trim59、Dhx33、Map3k13和Map3k20)，验证了在METTL3敲低的HULEC-5a细胞中这5个候选基因的mRNA水平。在HULEC-5a细胞中，只有Trim59被METTL3持续下调。m6A测序在对照组和m6A敲低组中分别鉴定出32757和33227个m6A峰（图4. B）。当m6A甲基化组被定位时，确定了m6A共有基序GGAC(图4. C)。与对照组相比，经shMETTL3处理的HULEC-5a细胞中，Trim59mRNA外显子周围的m6A峰的大小显著减小(图4. D)。m6A MeRIP-seq验证结果表明，与shRNA对照组相比，m6A特异性抗体显著降低了METTL3敲低诱导的Trim59mRNA的富集(图4. E)。并且敲除METTL3基因可以缩短Trim59的半衰期(图4. F)。RIP结果发现，YTHDF1在Trim59mRNA中明显富集于YTHDF2，而不是YTHDF2和YTHDF3，这表明YTHDF1与Trim59mRNA之间存在相互作用(图4. G)。YTHDF1沉默降低了LPS诱导的HULEC-5a细胞中Trim59的表达(图4. H)。METTL3介导的m6A修饰通过YTHDF1依赖的Trim59mRNA的稳定性维持了Trim59的表达。

05  METTL3通过靶向Trim59调节内皮功能
为了进一步确定METTL3是否通过靶向Trim59调控内皮功能，文章将Trim59 siRNA共转染到过表达METTL3的HULEC-5a细胞中（图5. A-B）。经内皮电阻(TEER)结果显示，在METTL3过表达的细胞中，敲除Trim59，部分逆转了METTL3对脂多糖诱导的内皮损伤的保护作用（图5. C）。当Trim59表达下调时，METTL3过表达介导的内皮屏障恢复被显著抑制（图5. D）。此外，Trim59的敲除加剧了内皮细胞的炎症反应(图5. E)。表明METTL3通过部分调节Trim59的表达来改善LPS诱导的血管内皮损伤。

06  METTL3通过Trim59相关的NF-kB失活抑制脓毒症诱导的ARDS的内皮损伤
为了确定METTL3介导的内皮损伤抑制是否参与了Trim59的调控，文章评估了METTL3对NF-kB通路因子表达的影响。METTL3过表达通过降低p65磷酸化显著抑制NF-kB通路(图6. A)，特异性NF-kB信号抑制剂BAY抑制p65磷酸化则降低METTL3诱导的内皮损伤标志物的表达(图6. B)。Trim59的下调显著促进了NF-kB通路的激活(图6. C)。这些数据表明，METTL3通过trim59相关的NF-kB失活调节脓毒症诱导的ARDS的内皮功能。

该篇文章通过RNA-seq和 m6A MeRIP-seq分析发现，Trim59是TRIM家族的一个成员，是HULEC-5a细胞中METTL3敲除时被抑制的基因。文章发现METTL3介导的m6 A修饰在脓毒症肺中被调节异常，证实了m6A修饰在脓毒症诱导的ARDS中的一种新功能。研究还显示了METTL3在调节血管内皮屏障功能中的关键作用。此外，在机制上，METTL3通过trim59相关的NF-kB失活来抑制脓毒症诱导的ARDS的内皮损伤。该文章为脓毒症相关ARDS的新治疗策略的发展提供了见解，并揭示了这种修饰在脓毒症相关肺损伤的诊断、预后和分子靶向治疗中的应用价值。

 

01 m6A RNA修饰测序

m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）

对m6A RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

• m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA测序
• m6A  miRNA测序

 

02 检测整体m6A RNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平

精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

 

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

 

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

 

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 双荧光素酶实验

验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。

5.4 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

 

优势一：云序累计支持客户发表  83  +篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子 795  +

优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：独家提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：国内最全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。

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