客户文章|新型RNA修饰之m7G揭示急性髓系白血病发病机制
2022年7月5号，云序客户山东大学齐鲁医院王冉课题组在Frontiers in Oncology杂志上发表文章“Transcriptome Profifiling of N7-Methylguanosine Modifification of Messenger RNA in DrugResistant Acute Myeloid Leukemia”。该文章通过m7G-MeRIP-seq&RNA
m7G RNA甲基化是在甲基化转移酶的作用下，使RNA鸟嘌呤（G）的第七位N上加上甲基的一种修饰（ N7-methylguanosine，m7G）。研究表明，m7G RNA甲基化修饰存在于各类分子中，包括：mRNA 5’帽子结构、mRNA内部、pri-miRNA、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）。m7G RNA甲基化修饰能够调节mRNA的转录、miRNA的生物合成和生物学功能、tRNA稳定性、18S rRNA的核内加工及成熟。m7G RNA甲基化修饰作为一类新型RNA甲基化，近两年高影响因子文章不断，是继m6A修饰之后的又一表观转录组学热点。近年来，越来越多的证据表明，转录后甲基化修饰与**的发生密切相关。然而，AML中m7G修饰的mRNA谱及其在耐药AML中的作用尚不清楚。2022年7月5号，云序客户山东大学齐鲁医院王冉课题组在Frontiers in Oncology杂志上发表文章“Transcriptome Profifiling of N7-Methylguanosine Modifification of Messenger RNA in DrugResistant Acute Myeloid Leukemia”。该文章通过m7G-MeRIP-seq&RNA-seq分析了人的早幼粒细胞的m7G甲基化谱，为m7G甲基化在AML耐药进展中的新功能提供了新的见解。云序生物有幸参与了m7G-MeRIP-seq&RNA-seq及生信分析，接下来，通过文章介绍，与各位老师一同了解如何*凭测序技术来实现文章的快速发表。
发表期刊：Frontiers in Oncology
发表日期：2022年7月5日
影响因子：5.738
研究方法：RNA-seq、m7G-MeRIP-seq（云序提供）
样品类型：细胞
文章链接：Frontiers | Transcriptome Profiling of N7-Methylguanosine Modification of Messenger RNA in Drug-Resistant Acute Myeloid Leukemia (frontiersin.org)
技术路线
研究内容
1、HL60和HL60/MX2细胞中m7G甲基化的一般特征
对HL60和HL60/MX2细胞中进行了RNA-seq和m7G-MeRIP-seq测序分析。分析结果显示，在HL-60组中，发现了8070个甲基化特征峰，**了5571个基因的转录本。HL60/MX2组共鉴定出8122个峰，分别对应于5979个基因转录本。并且，两组中只出现了495个相同的峰。与HL60组相比，HL60/MX2组有7627个特异性峰和7575个缺失峰，说明HL60组和HL60/MX2细胞之间的m7G甲基化修饰特征存在**差异。此外，还发现了在HL60细胞中，每个基因的特异性甲基化基因的平均峰数为2.47，而在HL60/MX2细胞中为2.19。
2、m7G甲基化的分布特征
对不同染色体上mRNA的m7G甲基化峰的分布进行分析，发现每条染色体上的m7G峰的数量和分布存在差异。其中，1号和2号染色体上的m7G峰数**，21号染色体上的m7G峰数**。从两组间m7G峰比较，6号和19号染色体上差异*为明显。两组患者的常染色体甲基化水平普遍高于性染色体。作者发现HL60和HL60/MX2细胞中大多数甲基化的mRNA只有一个m7G峰（分别为70.8%和74.3%）。在两组中，约20%的基因记录了2个m7G峰，不到10%的基因包含超过3个m7G峰。
3、差异调控的m7G甲基化基因的分析
为了比较m7G甲基化基因在HL60和HL60/MX2细胞中的差异表达，作者对两组的m7G修饰基因进行了统计学分析。与HL60细胞相比，HL60/MX2细胞中427个基因m7G甲基化上调，452个基因m7G甲基化下调。
4、m7G甲基化的基序分析和区域分析
作者发现两组间的MOTIFs序列均有**性差异。并且，在分析了m7G甲基化位点后，结果显示，该甲基化修饰分布在所有mRNA区域。其中，CDS区域甲基化修饰*多，其次是3’UTR区域，StartC和StopC区域甲基化修饰*少。差异修饰基因在HL60和HL60/MX2细胞中的区域分布相似。对m7G甲基化修饰的峰密度进行了统计分析表明，两组在CDS区域的m7G峰数量相似。与HL60/MX2细胞相比，HL60细胞在5’UTR区m7G峰更少，在3’UTR区更多。
5、差异表达的m7G-甲基化基因与mRNA表达联合分析
RNA测序分析显示，HL60/MX2细胞中4801个基因的表达与HL60细胞相比，差异有统计学意义，其中1451个基因表达上调，3350个基因表达下调。之后，作者对m7G-MeRIP-seq和RNA-seq的表达情况进行了联合分析。结果显示，在116个低mRNA表达的基因中，38个基因的m7G甲基化程度**上调，78个基因的m7G甲基化程度**下调。
6、m7G甲基化基因的生物信息学分析
为了研究m7G甲基化修饰在诱导AML细胞耐药中的病理生理作用，作者对HL60/MX2和HL60细胞中不同的m7G甲基化基因进行了GO富集和KEGG通路分析。在生物合成中的生物过程(BP)方面，HL60/MX2中m7G基因的甲基化上调，细胞主要与蛋白水解、水解酶活性的调节和细胞蛋白代谢过程有关，而低甲基化的m7G基因主要与生物发生有关。在分子功能(MF)方面，甲基化的m7G基因主要与嘌呤核糖核苷三磷酸结合、嘌呤核糖核苷酸结合、嘌呤核苷酸结合和核糖核苷酸结合有关，而低甲基化的m7G基因主要与atp依赖的微管运动、动力蛋白中间链结合和运动活性有关。在细胞成分中，高甲基化的m7G基因主要与细胞质、孔复合体和质膜边界细胞投射有关，而低甲基化的m7G基因主要与轴突、纤毛质、轴索动力蛋白复合体和细胞骨架有关，KEGG分析结果显示，HL60/MX2细胞中m7G上甲基化修饰的mRNA主要参与肥厚型心肌病、补体及凝血级联通路以及GnRH信号通路。低甲基化m7G修饰的mRNA在ABC转运体、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和氨基酸生物合成中**富集。
总 结
文章使用m7G-MeRIP-seq联合RNA-seq测序技术，得到了AML细胞(HL60)和耐药AML细胞(HL60/MX2)中mRNA的m7G甲基化修饰谱和表达谱，并分析了两组之间的差异。研究在HL60和HL60/MX2细胞中发现了超过10000个m7G峰和近10000个m7G甲基化基因，并发现m7G甲基化修饰状态存在**差异。Motif分析显示，耐药AML细胞和非耐药AML细胞之间存在**差异，暗示两组间甲基化修饰的差异可能与m7G甲基化酶的类别有关，但是，这还需要进一步的实验来证实。该篇文章为纯测序快速发表新型RNA修饰相关文章提供了一个新思路。
云序生物m7G修饰研究五大模块
01 m7G RNA修饰测序
m7G RNA修饰测序
对m7G RNA甲基化，目前***的检测手段为merip-m7G-Seq技术，适用 m7G RNA甲基化谱研究，快速筛选m7G RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m7G测序：
- m7G 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m7G LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m7G Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m7G mRNA测序
- m7G rRNA测序
- m7G circRNA测序
- m7G tRNA测序
02 检测整体m7G RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
**高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 m7G RNA修饰上游酶的筛选
m7G RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m7G RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m7G RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究
RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
-- 云序生物服务优势 --
优势一：云序累计支持客户发表83 +篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子795分+
优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，**覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：**检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供m7G一站式服务：m7G整体水平检测、m7G-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：**提供多种 RNA 修饰测序服务，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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