苯酚—次氯酸盐光度法测定牛奶中的氨和尿素

蛋白质在哺乳动物体内代谢产生氨, 最终生成尿素, 这两种物质也少量存在于它们的乳汁中。氨和尿素是乳汁中的非营养成分, 含量过高甚至对饮用者的身体有害。但有不法之徒为提高掺水牛奶的蛋白质检测值, 置消费者的健康于不顾,在向牛奶中掺水的同时, 还加入铵盐或尿素等含氮物。为保护消费者的权益, 打击制假贩假, 必须检测牛奶中氨和尿素的含量。我们在原来工作[ 1 -2] 的基础上, 采用黄豆粉水解液作脲酶, 水解尿素产生氨, 氨再由苯酚— 次氯酸盐光度法测定,从而提出一种测定牛奶中氨和尿素的新方法, 该方有操作简便, 灵敏度高, 结果准确等优点。

1　实验部分

1.1 　实验原理

脲酶水解尿素产生氨。在碱性条件下, 氨由亚硝基铁氰化钠催化, 与苯酚和次氯酸盐反应生成蓝色可溶性物质, 此物质可用比色法测定。

1 .2　仪器与试剂　LAl64 电子分析天平(常熟市衡器厂):721型分光光度计(上海第三分析仪器厂):恒温水浴等。脲酶溶液:称取过60 目筛的黄豆粉25g , 置研钵内, 加少许70 %的甘油研磨, 再以70 %甘油稀释至500ml , 混匀后静置, 取上层液使用;0.5mol/ L 硫酸:28ml 浓硫酸, 溶于约800ml 无氨水中, 冷却后补无氨水至1000ml ;10%钨酸钠溶液:称取钨酸钠50g , 用无氨水溶解并稀释至500ml;氨氮标准液:将硫酸铵(AR)烘干, 准确称取0.4714g , 用无氨蒸馏水溶解, 并定容至1000ml, 为储备液, 吸取5.00ml 储备液, 用无氨蒸馏水稀释, 定容至100ml, 即氨浓度为0 .005mg/ ml 的标准液:显色液I :称取苯酚25g , 亚硝基铁氰化钠0 .125g , 分别用无氨水溶解后混合,并稀释至500ml;显色液Ⅱ :称取NaOH 12 .5g , 用无氨水溶解,加入20ml 安替福民(NaClO 含量为70g/L), 补无氨水至500ml 。

1 .3　实验方法

1 .3.1 　工作曲线的制作　吸取一定量的氨氮标准液于25ml具塞比色管中, 依次加入显色液I 和显色液Ⅱ 各2.5ml, 用无氨水定容至刻度, 摇匀后置37 ℃, 恒温水浴保温30min, 取出, 在620nm 下, 用1cm 比色皿, 以试剂空白作参比, 测定吸光度。

1 .3.2 　牛奶中氨氮的测定　吸取2.5ml 待测牛奶, 加7.5ml无氨水稀释, 再依次加入0 .5mol/L 硫酸1 .0ml 和10%钨酸钠1 .0ml, 摇匀后离心以3000r/min 离心10min, 取上清液0.250ml于25ml 具塞比色管中, 按1 .3.1 步骤显色, 并测定吸光度。

1 .3.3 　牛奶中尿素的测定　吸取2.5ml 待测牛奶, 加入等量无氨水, 摇匀, 再加入5 .0ml 脲酶溶液, 混匀后置37℃水浴中保温30min, 取出, 依次加入0.5mol/ L 硫酸1.0ml 和10%钨酸钠1 .0ml, 摇匀后离心以3000r/min 离心10min, 取上清液0.250ml,于25ml 具塞比色管中, 按1 .3.1 步骤显色, 并测定吸光度。2 　结果与讨论2.1 　工作曲线　分别吸取0.0 、0.5、1.0、1.5 、2.0、2 .5 、3.0、3 .5、4 .0ml 氨氮标准液于9 只25ml 具塞比色管中, 按1.3 .1 步骤操作, 依据测定值绘制工作曲线。结果表明:氨氮浓度在0.0

-0.6mg/ L 范围内符合比耳定律, 表现摩尔吸光系数ε620=1 .9×104mol/ L·cm-1 , 线性回归方程A =1 .08CN(mg/L)-0.002 ,线性相关系数r =0.9992, 氮的检出限为5 .6×10-6g/ L。2.2 　样品的测定　样品按1.3.2 和1.3.3 步骤测定, 据测定的吸光度值, 在工作曲线上查出样品管的氨氮浓度(mg/ L), 依王武生等的方法[ 13] , 将脲酶水解后所测氨氮值乘以90 , 即为每100ml 牛奶中尿素的毫克数。类比于此, 将按1 .3.2 步骤测出的氨氮值乘以51 , 即得每100ml 牛奶中氨的毫克数。