酵母表面展示与噬菌体展示在纳米抗体研发中大比拼
噬菌体展示技术与酵母展示技术是目前抗体研发过程中常用的技术，特别是噬菌体展示技术，其对实验设备要求很低，常规分子生物学实验室即可开展该实验技术，加上大容量的文库库容，使得该技术被大家广泛使用。 与之相比，酵母展示技术虽然发展了很多年，但是其对设备要求较高，需要配置流式分选仪，流式分析仪等，加上库容量有限，所以目前并未被广泛使用。 阿帕克生物核心技术团队从事噬菌体展示技术11年，酵母展示技术4年，本期内容基于我们的从业经验为大家介绍这两种技术的优劣势，供大家在针对不同靶分子与分子需求时更好的去选择研发平台。
酵母展示技术是一种广泛应用于研究和工业生产的通用工具，最早由Maarten P. Schreuder及其同事在1993年报道了酵母细胞壁外源蛋白的展示，K. Dane Wittrup和同事在1997年报道了酵母表面多肽展示文库的构建和筛选。目前酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白工程，抗体开发，亲和力改造等。
酿酒酵母细胞壁厚且坚硬，约200nm，位于质膜外，主要由甘露蛋白和β-链葡聚糖组成，具有双层结构，包括内部的葡聚糖骨架层，以及主要由甘露蛋白组成的纤维状或刷子状外层(图1)。
图1 酿酒酵母细胞表面结构
通常，目的蛋白的展示通常是通过与宿主酵母细胞壁蛋白融合表达而实现的，常用的锚定蛋白如a-凝集素、Flo1p、Yps1p、Cwp2p、Sed1p、Pir1-4等（图2）。展示的蛋白经分泌途径，首先被转运到内质网腔内，然后从内质网转运到高尔基体，最终锚定于细胞壁表面。常用的锚定蛋白如a-凝集素由Aga1基因编码的核心亚基和Aga2基因编码的核心亚基组成，Aga1与Aga2亚基通过二硫键相连，并通过AGA1蛋白C端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞壁。展示的目的蛋白可选择融合于Aga2亚基的N端或C端进行构建，纳米抗体片段VHH融合 于N端或C端均可进行高效表达和筛选。
图2 不同的酿酒酵母细胞表面展示系统
酵母表面展示主要是通过MACS/FACS来进行筛选，筛选过程采用FACS进行监测，非常直观与方便。
噬菌体展示（phage display）是一种利用实验室进化，高通量、高内涵地淘选具有特定结合能力的多肽或抗体的分子生物学技术，已广泛用于生物医药、新材料、新能源及环保相关的基础与应用研究中。这项技术最初由George Smith在20世纪80年代中期开发，并在90年代初由John McCafferty和Gregory Winter应用在抗体工程领域。2018年，噬菌体展示研究的两位先驱，美国科学家乔治·史密斯（George P. Smith）和英国科学家格雷格·文特（Gregory P.Winter）荣获诺贝尔化学奖。
噬菌体展示技术是将外源的多肽，抗体等片段，插入到噬菌体的结构基因，常见的是与PIII或PVIII融合表达，被展示在噬菌体表面的分子仍然保持生物活性。要从噬菌体文库中挑选中我们想要的分子，就要经过 “淘筛”。该过程简单地说就是被展示在噬菌体表面的肽库或者蛋白库能够特异地与目标抗原识别并结合，经过足够时间的孵育之后，可使用洗涤液洗去与抗原结合较弱或者未结合的游离噬菌体。随后将特异性结合的目标噬菌体洗脱下来，感染大肠杆菌并进行扩增以得到下一轮的子噬菌体库。随后经过2轮～3轮的“吸附-洗脱-扩增”富集过程后，能够与抗原特异性结合的噬菌体的比例得到了逐步提高。最终获得能够识别靶分子的多肽或者蛋白，可被用于后续的实验。
✎ Phage display VS yeast surface display
虽然两种展示系统都能够实现基因型与表型的统一，且被广泛应用于抗体开发，但是在蛋白表达系统，库容量，筛选方式 等方面，二者存在很大差异。
噬菌体是一种病毒，需要感染大肠杆菌才能进行复制与扩增，是原核表达体系。但抗体是来源于真核，由于密码子的偏好性，不能够让有些抗体能够得到有效的展示或有毒，导致克隆丢失。而酵母是真核表达系统，展示的抗体首先 转运至内质网腔内，然后经高尔基体进行加工， 能够保证蛋白的正确折叠 ， 具有更接近真核表达蛋白的修饰特征及更良好的生物学的活性。
由于大肠杆菌的转化效率要远高于酵母细胞，一般噬菌体文库可达到 1 0 9 。而在很长的一段时间由于技术的限制，酵母文库的库容量只能达到 1 0 6 ~ 10 7 ，因此酵母表面展示一般用于亲和力成熟，这种突变文库，其对库容量要求不高。纳米抗体不涉及传统抗体轻重链体外重组，阿帕克生物经过技术改良目前文库库容量能够保证 1 0 8 ，完全能够满足纳米抗体的研发需要。
噬菌体展示文库采用酶切连接或者同源重组，其中酶切连接的方式大家最常用，相对于体外同源重组成本更低。体外同源重组可以大大提高连接效率，但成本非常高。酵母表面展示是将线性化的目的片段和线性化载体按一定比例电转化酵母感受态细胞，片段和载体会在酵母细胞内通过同源重组的方式环化为质粒，成本低廉，操作简单。
在抗体开发过程中，噬菌体展示文库一般采用单价展示，为了达到单价展示，包装后展示效率大约 1 0 %左右，但是并没有有效的检测手段去监测文库的包装效率，非常让人头疼。如果筛选不好，可能是展示效率不好导致的，引入了更多的变量，建议采用抗g 3 p 抗体，检测包装效率。
酵母表面展示会带检测标签比如HA，Flag，myc等，可以非常方便的通过流式确定文库表达效率，一般展示效率可以达到60%~80%。酵母表面展示是多价展示，一个酵母上大约会有104 ~105 个拷贝。
噬菌体展示承载分子量有限一般将多肽，VHH，ScFv或者Fab 融合到PIII蛋白上， Fab片段对噬菌体就相对较大了。 分子量太大，会影响噬菌体的侵染与包装。然而酵母展示除了可以展示上述的片段外，还可以展示整个抗体IgG分子全长，这是噬菌体展示无法做到。
噬菌体的偏向性非常严重，主要是由 3个方面引入的a.噬菌体是原核体系，而抗体来源于真核，由于密码子的偏好性和有些分子对E . coli有毒，导致克隆生长过程中生长速率不一致，甚至导致克隆丢失；b.没有插入片段的克隆，生长速度远远超过插入片段的克隆，导致文库质量降低；c. ORF 读码框不正确，也会导致这类克隆生长过快。酵母一般不会存在这类问题，生长相对较均一。
酵母展示最直接的优点是在FACS筛选过程中对选择参数的精确控制。收集的种群百分比，信号归一化，和所需的结合亲和力可以通过流式细胞术划定边界。这种在选择过程中定义结合标准的能力比噬菌体展示平台具有优势，在噬菌体展示平台上，变异识别依赖于洗涤步骤，而不是实时动力学观察。换句话说，在酵母文库选择过程中，这种对理想结合特性的系统性偏向在噬菌体文库筛选中是不存在的。酵母表面展示的筛选方法与流式细胞术提供的定量和多参数分析兼容。可对缓冲液组成、pH、温度和抗原浓度等条件进行精确控制，分选在特定孵育条件下与靶蛋白结合的克隆，如可分选在特定条件下稳定性提升的克隆，同时可以逐个分析文库中的每个细胞，以实时了解展示水平及其抗原结合情况，并分选出特定的细胞群。我们以实际案例来展示酵母筛选的优势：
a.基于亲和力的分选
噬菌体筛选高亲和力克隆是通过增加选择压比如包被抗原浓度，洗涤强度等方法，但是却不能进行有效监控，同时筛选到的克隆只能区分阳性，不能分辨亲和力高低， 只能在蛋白表达后再做亲和力比较，导致工作量大 ，成本高。 酵母展示是通过将待分选文库经不同浓度的靶蛋白孵育后，在一定的靶蛋白孵育浓度下可区分不同亲和力的抗体展示克隆，并按需求进行分选。 如图6所示，分选细胞与不同浓度靶蛋白孵育后的流式图谱，可观察到在11.1nM浓度条件下对不同亲和力的细胞群有较明显的区分,可以按亲和力高、中、低划分不同分选区进行分选，直接分选高亲和力群。 这种方式也可以反应出文库中是否有高亲和力的群，以及不同亲和力群的占比。
（靶蛋白孵育浓度从左至右分别为100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nM）
对于免疫检查点的靶点，为了获得具有生物学功能的抗体，需要阻断受体与配体的结合。常规的噬菌体筛选是先拿到结合的抗体，表达验证后再验证是否能blocking 受体与配合的结合，效率低，成功率不高。酵母表面展示是通过对配体蛋白或bench mark抗体进行染色标记，通过竞争分选来获得。如分选PD-L1的阻断抗体，将PD-L1和PD-1标记为不同的荧光，与文库细胞共孵育后分选表达信号阳克隆中PD-L1荧光信号阳而PD-1信号阴的克隆，见图7所示分选图谱，分选F-Q1区细胞，经鉴定细胞结合PD-L1后不再结合PD-1，即抗体具有阻断PD-L1与PD-1结合的功能，效率非常高。
（2）
（1：PD-L1标记荧光650，PD-1标记荧光PE，分选650信号阳性且PE信号阴性的区域F-Q1；2：分选产物流式鉴定图谱，左信号PD-L1-647/HA-488，右信号PD-1-PE/PD-L1-647）
噬菌体的筛选类似于ELISA，一般会通过2~3轮的panning，这个过程为了保证克隆的多样性，应尽量减少淘洗的轮次，不要让output阳性率太高。其次丝状噬菌体比较黏，容易出现非特异，酵母则是通过检测表达标签与抗原结合双阳信号来控制，非特异非常低。酵母展示一般第一轮进行MACS富集，第二轮采用FACS进行分选，直接分选特定群，通过控制分选精度，可以让阳性率达到90%以上，且不丢失多样性。 传统的克隆分析是通过挑取单克隆来进行验证与sanger测序，一般挑取5~10块板，这种方式往往挑选到的都是丰度比较高的克隆，对于低丰度的克隆，很难通过这种方式获得，数据量有限。酵母展示除了这种挑单克隆的方式来获得克隆外，阿帕克生物采用分选特定群10W+的阳性克隆，进行NGS测序，分析深度是传统挑克隆无法比拟的，获得的数据可以进行丰度排序，或者基于CDR3进行cluster聚类，轻松获得上百条后选克隆。噬菌体由于比较黏且容易非特异，NGS测序的结果阳性克隆的置信度非常低，往往我们合成的克隆没有几个是阳性。
阿 帕克 生物酵母展示系统是基于酿酒酵母 EBY100和低拷贝质粒进行搭建的。 表达的文库蛋白通过柔性linker与AGA2p蛋白融合，并含有展示标签，通过对标签的荧光染色可以在流式仪上观察展示效率并对数据进行归一化分析。 目的蛋白与AGA2p蛋白的N端或C端融合进行表面展示。 质粒包含宿主酵母菌缺失的TRP1基因，以确保质粒传代稳定性。 阿帕克生物专注于纳米抗体研发，将酵母展示技术应用于抗体发现及蛋白质工程等领域，并提供抗体发现、抗体亲和力成熟、T细胞受体亲和力提升等服务。目前已为国内外200多家企业提供了500+的项目开发，经验丰富，欢迎咨询。
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