实验储备 | siRNA转染操作及要点
一文读懂siRNA实验流程、技巧…
siRNA（小干扰RNA）是一种新型的基因治疗工具，是由21-25个核苷酸组成的双链短RNA分子，能够特异性地诱导靶基因的沉默，进而抑制蛋白的表达。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被证明可以特异性地抑制哺乳动物细胞中的靶基因表达。这一发现由David Baulcombe团队在《科学》杂志上发表，成为当年全球十大科学进展之首，他的团队并于2006年荣膺了诺贝尔生理学或医学奖。
siRNA的抑制作用是通过其与AGO蛋白组装成的RNA诱导沉默复合体（RISC）发挥的。一条链被降解，另一条链则与靶基因的mRNA互补配对，使其被切割降解，从而达到治疗相关疾病的目的。与传统的基因治疗相比，siRNA具有高度特异性、快速、可逆性等优点，可以应用于各种真核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选中广泛应用。例如siRNA靶向恶性肿瘤的基因可以通过局部或系统性给药来治疗肿瘤，病毒感染和遗传疾病也都有涉及。
siRNA 抑制蛋白表达机制
为了方便使用，常规siRNA产品以冻干粉形式提供，可以直接用于各种细胞RNAi实验。科研人员可以根据需要设计特定靶点，覆盖人、小鼠、大鼠全基因组的所有基因。同时，通过对siRNA进行化学修饰，可以提高其在体内实验中的高效性、特异性和稳定性。
RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程，常常被用作基因沉默（基因干扰）的工具之一。siRNA作为RNAi的一种形式，具有非常广阔的应用前景。未来，siRNA还将继续发挥其独特的优势，成为治疗相关疾病的新趋势。
siRNA转染实验介绍
01- siRNA储存
常规化学合成的siRNA序列为21～23nt的双链小分子RNA，为冻干粉形式的即用型试剂 ，在常温不溶解的情况下可以保存至少1个月时间，放置于-20℃～-80℃低温环境中，冻干粉可以稳定保存一年。
02- 转染试剂储存
4℃保存，不可冷冻。
03-体外转染操作流程：
第一步、接种细胞：建议提前一天接种细胞，接种数量参考下方推荐量。
第二步、 转染复合液配制：
● siRNA稀释液配制：siRNA以水稀释至140 μg/mL。
● siRNA转染复合液配制：取无菌离心管，加入2μL siRNA稀释液，加入LipidnanoTM Super RNAi转染试剂A液14μL，吹打混匀，加入LipidnanoTM Super RNAi转染试剂B液4μL，混合均匀，室温放置5min，加培养液180μL，吹打混匀。
第三步、细胞加样：按下方推荐量将配制好的siRNA转染复合液加入各细胞孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
第四步、细胞培养：37 ℃，5% CO2 培养箱培养，直至发挥干扰作用。建议24~48h测定mRNA水平、48~72h测定蛋白水平。
操作流程示例
siRNA样品加入示例
注：使用本转染试剂对细胞进行siRNA转染时，为了获得最佳基因沉默效果，每一种细胞系转染siRNA的剂量都需要经过实验确定最佳范围。
示例中使用的体外转染试剂为同立海源生产的LipidnanoTM Super RNAi转染试剂，主要应用于：贴壁细胞和悬浮细胞转染，部分原代细胞和转化细胞株的基因转染，siRNA高通量转染试验。在进行体外转染实验的过程中，实验还需注意这些细节：
❶ 转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率，并确保 siRNA/miRNA 基因沉默表达不会影响细胞活力。
❷ 首次转染：如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个siRNA转染试剂复合液浓度，并在0.014μg/mL~0.70μg/mL范围内改变siRNA的浓度，根据首次转染结果调整剂量水平。
❸ siRNA转染试剂稀释液的选择：对培养基无特殊要求，可使用完全培养基进行稀释，不强要求减/无血清培养基。
❹ 浓度换算：摩尔浓度与质量浓度之间的换算关系可根据siRNA分子量可进行同步换算。X nmol/L*分子量=Y ng/L，如分子量为14000的siRNA，1nmol/L*14000=14000ng/L=14μg/L。
❺ 转染细胞密度：推荐在70％左右时进行转染。通常基因沉默的分析要在转染后24小时进行。本转染试剂极低的细胞毒性可以方便研究者根据目的细胞生长特性，靶基因的表达特性，选择适合条件进行转染。健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性。通常健康的细胞转染效率较高，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。推荐用50代以下的细胞转染。
❻ 阳性对照选择：通过合适的阳性对照、实验siRNA优化转染和检测条件，对大多数细胞，GADPH-siRNA是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照siRNA或实验siRNA转入靶细胞，转染24小时后，以内参基因如β-actin mRNA为对照，统计目标mRNA相对于未转染细胞的降低水平。
传统转染试剂可通过表面正电荷帮助siRNA大量摄取入胞，但入胞后siRNA内含体逃逸水平低，造成摄取的siRNA无法发挥作用，同时造成细胞毒性。本品为非强正电性脂质转染试剂，避免细胞大量摄取造成的毒性，但本品可提升细胞内吞后的siRNA内含体逃逸效率，通过促进内含体逃逸使更多siRNA释放入细胞质中实现高效基因沉默作用。故在细胞水平上通过荧光标记siRNA进行条件优化的方法不适用于本转染试剂。推荐使用Western Blot或QPCR方式对最佳转染浓度进行优化。
❼ 操作注意：siRNA与转染试剂A液实现充分混合后加入B液，继续混合均匀，放置5min后加入培养基稀释，稀释后需在1h内加入细胞孔内。将siRNA转染试剂复合液加至每一个包含细胞和培养基的孔中，加入后可以轻轻地前后摇动培养板混合均匀。
❽ 避免RNA酶污染：微量RNA酶会导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品。因此请确保实验每个步骤不受RNA酶污染。推荐使用商业化无酶实验耗材。
❾ 效果评价：细胞转染后，不同细胞和siRNA效率存在差异。在mRNA水平观察siRNA效果的最佳时间是转染后24~48小时，在蛋白水平观察siRNA效果的最佳时间是转染后48~72小时。siRNA干扰是非线性的，不同基因半衰期存在较大差异，首次进行siRNA干扰效果测定时，建议多点测定，确定最佳测定时间点。
已验证可高效转染细胞:
BEAS-2B; HEK293; HEK293T; HCT116; HT22; FibroblastP4；MCF-7; B16F10; Hela；HepG2; Raw264.7；AHH-1;H9; 原代小鼠血管内皮细胞；原代小鼠血管平滑肌细胞...
可关注同立海源公众号（服务号），发送申请试用，弹出二维码后即可
试用活动规则：
1.免费试用规格0.1mL；
2.由于免费试用名额有限，每个客户限申请一次（注*同一导师或同一公司为同一客户，不累计赠送。）；
3.申请要求：申请信息完整，能够近期开展实验；
4.其他说明：试用结束后，反馈试用结果；
5.本次活动最终解释权归北京同立海源生物科技有限公司。
siRNA沉默效果分析
siRNA 转染细胞后，siRNA 在细胞内一系列酶的作用下形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，识别并切割靶基因mRNA，诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应， 从而抑制了细胞内目的基因蛋白的表达，一般可从两个方面进行检测。
mRNA 水平 - qPCR检测：
siRNA的作用机理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接证明。一般在siRNA转染后24小时后即可检测到靶mRNA水平的降低，可采用细胞总RNA提取，全长cDNA合成，荧光定量实验即可检测到mRNA 的敲除效率。
蛋白水平 - WB检测：
siRNA引起靶基因mRNA的降解，从而影响了靶蛋白的表达。但蛋白水平检测时间受细胞内目的蛋白表达量、稳定性、半衰期、甚至其他调控等因素的影响，蛋白质水平下降的幅度与mRNA水平下降不一定成线性正比关系。一般在转染后48小时后开始WB检测，并于72小时、96 小时甚至更长时间之后多点采样。
小结：RNA转染过程中的影响因素比较多，主要可以归纳为转染方法、转染试剂和转染细胞等三个方面。除此之外，RNA的结构、RNA转染时RNA的用量、RNase的污染、进入细胞后RNA的降解等因素也会使RNA转染过程更加复杂、给转染结果带来影响，其中RNA在转入细胞后的降解问题在RNA转染过程中是比较重要的，如果转染的RNA在进入细胞体后大量降解，那么实验结果就很不准确了。
说明：本文仅用于传播知识、普及科学，不构成任何医疗建议，如有版权等问题，请随时联系我们。
咨询
- 425
- 点赞
- 复制链接
- 举报
